Quyết định 141/QĐ-K2ĐT năm 2015 về tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” do Cục trưởng Cục Khoa học công nghệ và Đào tạo ban hành

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH TÀI LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN THỬ NGHIỆM TIỀN LÂM SÀNG VÀ LÂM SÀNG THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU”

CỤC TRƯỞNG CỤC KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ ĐÀO TẠO

Căn cứ Luật dược số 34/2005/QH11 ngày 14/06/2005 của Quốc hội;

Căn cứ Nghị định số 63/2012/NĐ-CP ngày 31/8/2012 của Chính Phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;

Căn cứ Quyết định số 4059/QĐ-BYT ngày 22/10/2012 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Cục Khoa học công nghệ và Đào tạo thuộc Bộ Y tế;

Căn cứ Quyết định số 4313/QĐ-BYT ngày 19/10/2015 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc thành lập Hội đồng thẩm định “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”;

Căn cứ Biên bản họp ngày 26/10/2015 và Biên bản kiểm phiếu đánh giá của Hội đồng thẩm định “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”;

Xét đề nghị của Trưởng phòng Quản lý thử nghiệm lâm sàng và sản phẩm,

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”.

Điều 2. Các cơ sở nghiên cứu triển khai khi có nhu cầu về “thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” thực hiện nghiên cứu theo hướng dẫn này để triển khai các nghiên cứu đảm bảo tính khoa học và đạo đức.

Điều 3. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày ký ban hành.

Điều 4. Các Ông, Bà: Lãnh đạo Cục, Chánh Văn phòng Cục, Trưởng các Phòng, đơn vị thuộc Cục chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./.

HƯỚNG DẪN

THỬ NGHIỆM TIỀN LÂM SÀNG VÀ LÂM SÀNG THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU
(ban hành kèm theo Quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015)

Chủ biên

TS. Nguyễn Ngô Quang

Đồng chủ biên

GS.TS. Phạm Thanh Kỳ

BAN BIÊN SOẠN

TTND. BS. Trần Văn Bản

TS. Trần Thị Hồng Phương

TS. Nguyễn Bội Hương

PGS.TS. Nguyễn Nhược Kim

QUYẾT ĐỊNH

VỀ VIỆC BAN HÀNH TÀI LIỆU CHUYÊN MÔN “HƯỚNG DẪN THỬ NGHIỆM TIỀN LÂM SÀNG VÀ LÂM SÀNG THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU”

CỤC TRƯỞNG CỤC KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ ĐÀO TẠO

Căn cứ Luật dược số 34/2005/QH11 ngày 14/06/2005 của Quốc hội;

Căn cứ Nghị định số 63/2012/NĐ-CP ngày 31/8/2012 của Chính Phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Bộ Y tế;

Căn cứ Quyết định số 4059/QĐ-BYT ngày 22/10/2012 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn và cơ cấu tổ chức của Cục Khoa học công nghệ và Đào tạo thuộc Bộ Y tế;

Căn cứ Quyết định số 4313/QĐ-BYT ngày 19/10/2015 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc thành lập Hội đồng thẩm định “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”;

Căn cứ Biên bản họp ngày 26/10/2015 và Biên bản kiểm phiếu đánh giá của Hội đồng thẩm định “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”;

Xét đề nghị của Trưởng phòng Quản lý thử nghiệm lâm sàng và sản phẩm,

QUYẾT ĐỊNH:

Điều 1. Ban hành kèm theo Quyết định này tài liệu chuyên môn “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”.

Điều 2. Các cơ sở nghiên cứu triển khai khi có nhu cầu về “thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” thực hiện nghiên cứu theo hướng dẫn này để triển khai các nghiên cứu đảm bảo tính khoa học và đạo đức.

Điều 3. Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày ký ban hành.

Điều 4. Các Ông, Bà: Lãnh đạo Cục, Chánh Văn phòng Cục, Trưởng các Phòng, đơn vị thuộc Cục chịu trách nhiệm thi hành Quyết định này./.

HƯỚNG DẪN

THỬ NGHIỆM TIỀN LÂM SÀNG VÀ LÂM SÀNG THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU
(ban hành kèm theo Quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015)

Chủ biên

TS. Nguyễn Ngô Quang

Đồng chủ biên

GS.TS. Phạm Thanh Kỳ

BAN BIÊN SOẠN

TTND. BS. Trần Văn Bản

TS. Trần Thị Hồng Phương

TS. Nguyễn Bội Hương

PGS.TS. Nguyễn Nhược Kim

PGS.TS. Nguyễn Trần Thị Giáng Hương

ThS. Võ Thị Nhị Hà

TỔ THƯ KÝ VÀ BIÊN TẬP:

ThS. Lê Tuấn Hưng

ThS. Hoàng Hoa Lý

ThS. Nguyễn Chiến Binh

MỤC LỤC

CHƯƠNG I. ĐẠI CƯƠNG VỀ THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

1. Giải thích từ ngữ:

2. Đặc điểm chất lượng dược liệu và thuốc đông y Việt Nam.

2.1. Đặc điểm chất lượng dược liệu tại Việt Nam

2.2. Đặc điểm thuốc đông y Việt Nam

2.3. Các vấn đề cần nghiên cứu đối với thuốc đông y, thuốc từ dược liệu Việt Nam

CHƯƠNG II. HƯỚNG DẪN VỀ HỒ SƠ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU TIỀN LÂM SÀNG VÀ LÂM SÀNG THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

1. Thuốc đông y:

2. Thuốc từ dược liệu

CHƯƠNG III. HƯỚNG DẪN VỀ NGHIÊN CỨU TIỀN LÂM SÀNG THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

I. HƯỚNG DẪN VỀ TIỀN LÂM SÀNG

1. Động vật nghiên cứu

2. Dùng thuốc:

3. Điều kiện môi trường thí nghiệm

II. HƯỚNG DẪN VỀ KHẢO SÁT TÍNH AN TOÀN CỦA THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

1. Thử nghiệm về độc tính cấp diễn:

2. Thử nghiệm về độc tính bán trường diễn:

3. Thử nghiệm về độc tính tại chỗ:

4. Các thử độc tính đặc biệt

5. Yêu cầu về dữ liệu của tính hiệu quả và tính an toàn và dược lực học của nghiên cứu tiền lâm sàng

6. Hướng dẫn áp dụng:

CHƯƠNG IV. HƯỚNG DẪN THỬ NGHIỆM LÂM SÀNG THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

1. Các giai đoạn đánh giá hiệu quả lâm sàng

1.1. Giai đoạn 1:

1.2. Giai đoạn 2:

1.3. Giai đoạn 3:

1.4. Giai đoạn 4:

2. Các yêu cầu về Thực hành tốt lâm sàng (GCP) cho các sản phẩm đông y, thuốc từ dược liệu

2.1. Các hướng dẫn chung về thử nghiệm lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu

2.2 Một số hướng dẫn cụ thể

Phụ lục 1: Ngoại suy liều thể tích dung dịch mẫu thử dùng cho ĐVTN, phân loại độc

Phụ lục 2: Phương pháp xác định LD50 trong thử độc tính cấp

Phụ lục 3 Hồ sơ khoa học đính kèm nguyên liệu dùng làm thuốc đông y, thuốc từ dược liệu đối với vị thuốc chưa có trong Dược điển Việt Nam hoặc Dược điển nước ngoài

TÀI LIỆU THAM KHẢO

LỜI GIỚI THIỆU

Thuốc đông y, thuốc từ dược liệu đã được sử dụng từ lâu đời ở Việt Nam cũng như nhiều nước Châu Á và thế giới và thực sự đã có những đóng góp quan trọng trong công tác chăm sóc sức khỏe, phòng bệnh và chữa bệnh trong cộng đồng. Nhu cầu sử dụng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu ngày càng gia tăng và đã được nhiều nước quan tâm đưa ra những tiêu chuẩn quốc gia về dược liệu, quy chuẩn sản xuất thuốc đông y, thuốc từ dược liệu.

Bộ Y tế Việt Nam đã có những văn bản pháp lý phù hợp làm cơ sở cho các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. Đầu tiên là Quyết định số 371/BYT-QĐ ngày 12 tháng 3 năm 1996 về việc ban hành “Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền”. Gần đây nhất có Thông tư 03/2012/TT-BYT về Hướng dẫn thử thuốc trên lâm sàng của Bộ Y tế. Những văn bản này là cơ sở pháp lý cho hoạt động thử nghiệm lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu ở nước ta.

Căn cứ những văn bản hướng dẫn trên, trong những thập kỷ gần đây nước ta đã triển khai thực hiện nhiều nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng về thuốc đông y, thuốc từ dược liệu, đưa ra dạng bào chế hiện đại để tiện sử dụng, tiện lưu thông phân phối và bảo quản. Tuy nhiên vấn đề an toàn và hiệu quả của thuốc đông y, thuốc từ dược liệu chưa được nghiên cứu đánh giá đầy đủ, nhiều chế phẩm đang được sử dụng ở dạng thực phẩm chức năng vì chưa có hồ sơ đánh giá hiệu quả trên lâm sàng. Tổ chức Y tế thế giới - WHO và nhiều quốc gia trên thế giới đều có văn bản hướng dẫn riêng đối với việc thử nghiệm lâm sàng thuốc thảo dược. Việt Nam hiện chưa có quy định và hướng dẫn riêng đối với việc thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu.

Để góp phần xây dựng nguyên tắc nghiên cứu phù hợp với yêu cầu sử dụng thuốc an toàn, hiệu quả, tạo điều kiện đánh giá thống nhất kết quả nghiên cứu, thúc đẩy việc sản xuất thuốc đông y, thuốc từ dược liệu phục vụ rộng rãi hơn, sử dụng hợp lý đảm bảo an toàn và hiệu quả hơn, Lãnh đạo Bộ Y tế đã chỉ đạo xây dựng “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu”. Tài liệu này được soạn thảo và ban hành với mục đích góp phần tăng thêm kiến thức, tạo cơ sở cho việc thử nghiệm tiền lâm sàng, thử nghiệm lâm sàng và đăng ký cấp phép lưu hành thuốc đông y, thuốc từ dược liệu tại nước ta. Tài liệu gồm có bốn phần chính: (1) Đại cương về thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. (2) Hướng dẫn về hồ sơ kỹ thuật nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. (3) Hướng dẫn về nghiên cứu tiền lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. (4) Hướng dẫn thử nghiệm lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. Đối tượng hướng tới của tài liệu là những nhà nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, nhà sản xuất, nhà tài trợ cho nghiên cứu, nhà quản lý, người sử dụng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu tại Việt Nam.

Hướng dẫn do Cục Khoa học công nghệ và Đào tạo, thành viên Ban đánh giá vấn đề đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Bộ Y tế, các chuyên gia trong lĩnh vực liên quan chủ trì biên soạn, với sự tài trợ của Tổ chức Y tế thế giới. Hướng dẫn này không thay thế được các văn bản pháp quy của Bộ Y tế hướng dẫn về thử nghiệm lâm sàng, đăng ký và xin cấp phép thuốc đông y, thuốc từ dược liệu tại Việt Nam.

Trong quá trình biên soạn không tránh khỏi những thiếu sót. Ban biên soạn mong nhận được những đóng góp quý báu từ quý vị độc giả để tài liệu được hoàn thiện hơn, góp phần nâng cao chất lượng và hiệu quả thuốc đông y, thuốc từ dược liệu, bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng.

Chương I

ĐẠI CƯƠNG VỀ THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

1. Giải thích từ ngữ:

- Thuốc từ dược liệu là thuốc được sản xuất từ nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, thực vật hoặc khoáng chất. Thuốc có hoạt chất tinh khiết được chiết xuất từ dược liệu, thuốc có sự kết hợp dược liệu với các hoạt chất hóa học tổng hợp không gọi là thuốc từ dược liệu.

- Thuốc đông y là thuốc từ dược liệu, được bào chế theo lý luận và phương pháp của y học cổ truyền của các nước phương Đông.

- Vị thuốc đông y là một loại dược liệu được chế biến, bào chế theo lý luận của y học cổ truyền hoặc kinh nghiệm dân gian được sử dụng để phòng bệnh và chữa bệnh.

- Thuốc thang là dạng thuốc đông y gồm có một hoặc nhiều vị thuốc kết hợp với nhau theo lý luận của y học cổ truyền hoặc theo kinh nghiệm dân gian được sử dụng để phòng bệnh, chữa bệnh và được đóng gói theo liều sử dụng.

- Cổ phương: là bài thuốc được ghi trong sách cổ được cụ thể đến từng chi tiết: số vị thuốc, liều lượng từng vị, cách bào chế, chỉ định của thuốc, liều dùng, đường dùng và cách dùng.

- Cổ phương gia giảm là bài thuốc cổ phương được thêm hoặc bớt một số các chi tiết về: số vị thuốc, liều lượng của vị thuốc, cách bào chế vị thuốc, liều dùng, cách dùng, chỉ định dùng theo biện chứng của thầy thuốc nhằm tăng hoặc giảm nhưng không làm mất đi tác dụng chính của bài cổ phương từ đó đạt được mục đích chữa bệnh, hỗ trợ chữa bệnh hoặc có lợi cho sức khỏe con người.

- Tân phương (thuốc cổ truyền mới): là bài thuốc mới được thiết lập tuân theo phương pháp lý luận của y học cổ truyền có tác dụng chữa bệnh, hỗ trợ chữa bệnh hoặc có lợi cho sức khỏe con người.

- Thuốc gia truyền là những bài thuốc điều trị một chứng bệnh nhất định có hiệu quả được sản xuất theo phương pháp riêng biệt và được bí truyền lâu đời trong gia đình.

- Chất đặc trưng là một thành phần tự nhiên của vị thuốc đông y dùng làm tiêu chuẩn để xác định đảm bảo chất lượng cho chế phẩm thuốc cổ truyền và không nhất thiết phải là chất có tác dụng sinh học hay tác dụng điều trị.

- Hoạt tính sinh học là hoạt tính liên quan đến sự thay đổi về hình thái và chức năng cơ bản của động vật (hay tiêu bản của động vật) khi cho thử nghiệm thuốc cổ truyền trên động vật đó.

- Tác dụng điều trị (tác dụng chữa bệnh) là tác dụng làm giảm hoặc khỏi bệnh.

- Tác dụng hỗ trợ điều trị: (hỗ trợ chữa bệnh) là tác dụng liên quan đến việc làm tăng tác dụng điều trị của một thuốc khác.

- Tác dụng có lợi cho sức khỏe con người: là tác dụng có liên quan đến việc làm tăng chất lượng sống của con người.

Sách cổ: được nêu trong các bài thuốc: nội kinh, nạn kinh, kim quỹ yếu lược, và các bài thuốc ghi trong y văn của Hải Thượng Lãn Ông, Tuệ Tĩnh được Bộ Y tế công nhận.

2. Đặc điểm chất lượng dược liệu và thuốc đông y Việt Nam.

2.1. Đặc điểm chất lượng dược liệu tại Việt Nam.

- Đã có một số dược liệu trong nước trồng theo tiêu chuẩn GACP (Good Agricultural and Collection Practices) - Thực hành trồng trọt và thu hái dược liệu tốt, do đó đảm bảo chất lượng.

- Những dược liệu nhập từ nước ngoài qua đường chính ngạch đảm bảo chất lượng

- Chưa đồng đều: do nguồn dược liệu sử dụng từ nhiều địa phương khác nhau với điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng khác nhau sẽ tạo ra dược liệu với chất lượng khác nhau và chưa chăm sóc theo GACP nên chất lượng chưa ổn định và chưa an toàn.

- Có nhiều dược liệu ngoại nhập đã bị tách chiết hết hoặc còn rất ít hoạt chất.

2.2. Đặc điểm thuốc đông y Việt Nam.

- Thuốc đông y Việt Nam: một dược liệu có nhiều tên gọi khác nhau tùy địa phương được chế biến, bào chế khác nhau có thể dẫn đến thay đổi tính vị, quy kinh, tác dụng của vị thuốc.

- Dạng thuốc: đa dạng (dùng sống hoặc dùng chín) thuốc chiết xuất, sắc, hoàn, cao, ngâm rượu, viên nén, kem bôi,...

- Chất lượng thuốc chưa ổn định.

- Đa số thuốc chưa được đánh giá đầy đủ và khoa học.

- Có tác dụng phòng và chữa nhiều bệnh khác nhau.

- Phần lớn thuốc được điều trị theo kinh nghiệm.

2.3. Các vấn đề cần nghiên cứu đối với thuốc đông y, thuốc từ dược liệu Việt Nam.

- Đánh giá tính xác thực của thuốc (authenticity) với các tiêu chuẩn cảm quan, thực vật, hóa lý và nếu có thể cả tiêu chuẩn sinh học.

- Đánh giá chất lượng thuốc thông qua việc xác định giới hạn hàm lượng tạp chất, hàm lượng hoạt chất hoặc nhóm hoạt chất của dược liệu và những chất bị cấm.

- Đánh giá hiệu quả của qui trình bào chế cổ truyền.

- Đánh giá tính an toàn của thuốc.

- Đánh giá tác dụng điều trị.

- Đánh giá tác dụng hỗ trợ điều trị.

- Đánh giá tác dụng có lợi đối với sức khỏe con người.

- Các đánh giá khác tùy theo mục tiêu nghiên cứu.

Chương II.

HƯỚNG DẪN VỀ HỒ SƠ KỸ THUẬT NGHIÊN CỨU TIỀN LÂM SÀNG VÀ LÂM SÀNG THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

1. Thuốc đông y:

- Tên của chế phẩm: tên Việt Nam hoặc tên biệt dược đã được Cục Sở hữu trí tuệ Việt Nam cấp giấy chứng nhận nhãn hiệu có minh chứng kèm theo.

- Công thức bài thuốc: ghi tên từng vị thuốc bằng tiếng Việt và có tên khoa học kèm theo, ghi rõ liều lượng từng vị thuốc trong bài thuốc, vị thuốc đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam, tiêu chuẩn Dược điển nước ngoài hoặc tiêu chuẩn cơ sở. Phân tích bài thuốc theo lý luận y học cổ truyền.

- Xuất xứ của bài thuốc: trình bày rõ xuất xứ bài thuốc có minh chứng kèm theo ở phần phụ lục 3.

- Dạng bào chế: thuốc thang, thuốc bột, viên hoàn, viên tễ hoặc dạng thuốc hiện đại như viên nén, viên nang cứng, viên nang mềm...

- Quy trình chế biến từng vị dược liệu: trình bày rõ phương pháp chế biến theo y học cổ truyền của từng vị thuốc (sao, sao vàng,..., chích mật, chích muối, chích gừng, chích cam thảo, chích rượu, chích dấm,...).

+ Công thức và khối lượng nguyên liệu, phụ liệu.

+ Quá trình tiến hành.

- Quy trình sản xuất chế phẩm (thực hiện như thuốc từ dược liệu).

- Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng sản phẩm (thực hiện như thuốc từ dược liệu).

- Độ ổn định của chế phẩm (thực hiện như thuốc từ dược liệu).

- Báo cáo độ an toàn của chế phẩm (thực hiện theo hướng dẫn ở Chương III Hướng dẫn này).

2. Thuốc từ dược liệu

- Tên của thuốc: ghi tên Việt Nam hoặc tên biệt dược đã được Cục Sở hữu trí tuệ Việt Nam cấp giấy chứng nhận nhãn hiệu (có minh chứng kèm theo).

- Công thức của thuốc: nêu tên từng vị thuốc bằng tiếng Việt Nam có kèm theo tên khoa học của vị thuốc đó, ghi rõ liều lượng từng vị thuốc cho 01 đơn vị thành phẩm, vị thuốc đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam hoặc tiêu chuẩn Dược điển nước ngoài hoặc tiêu chuẩn cơ sở.

- Dạng bào chế: ghi rõ dạng bào chế (viên nén, viêm nén bao phim, viên nén bao đường, viên nang cứng, viêm nang mềm ...), hàm lượng của 01 đơn vị sản phẩm.

- Quy trình bào chế cao dược liệu bán thành phẩm (nếu có) bao gồm:

+ Công thức cho 01 mẻ sản xuất: bao gồm khối lượng dược liệu, dung môi dùng trong chiết xuất.

+ Quy trình sản xuất cao cần mô tả:

• Máy móc thiết bị dùng trong sản xuất cao.

• Sơ đồ các giai đoạn sản xuất cao.

• Mô tả quá trình sản xuất cao.

• Vệ sinh an toàn lao động.

• Phương pháp kiểm tra, kiểm nghiệm.

- Quy trình sản xuất chế phẩm bao gồm:

+ Công thức của 01 đơn vị thành phẩm.

+ Công thức cho 01 mẻ sản xuất (các nguyên liệu, phụ liệu - ghi rõ khối lượng từng loại).

+ Đặc điểm nguyên liệu, phụ liệu.

+ Sơ đồ các giai đoạn sản xuất.

+ Các thiết bị dùng trong sản xuất.

+ Mô tả quy trình sản xuất.

+ Vệ sinh vô trùng, an toàn lao động.

+ Kiểm soát và kiểm nghiệm (ghi rõ nội dung và phương pháp).

+ Nội dung kiểm tra trong quá trình sản xuất.

+ Dư phẩm, phế phẩm (cách giải quyết).

+ Hồ sơ làm việc cần thiết phải có.

- Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng cao bán thành phẩm (nếu có).

+ Yêu cầu kỹ thuật:

• Bào chế.

• Nguyên liệu và phụ liệu.

• Chất lượng thành phẩm.

+ Cách trình bày:

• Tính chất.

• Mất khối lượng do làm khô.

• Kim loại nặng độc: ghi rõ giới hạn.

• Định tính: bằng phản ứng hóa học, bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao.

• Định lượng: xác định hàm lượng hoạt chất, hoặc nhóm hoạt chất.

• Độ ẩm.

• Độ nhiễm khuẩn.

+ Phương pháp thử: ghi rõ phương pháp thử các chỉ tiêu trên.

+ Đóng gói, bảo quản.

- Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chất lượng thành phẩm: tùy theo dạng thành phẩm ghi rõ các chỉ tiêu chất lượng và phương pháp thử phù hợp - cần kèm theo phiếu kiểm nghiệm các chỉ tiêu chất lượng đã nêu của thành phẩm. (Phiếu của Viện Kiểm nghiệm thuốc hoặc của Phòng Kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP). Nếu dược liệu chứa chất cấm thì phải có báo cáo.

- Báo cáo kết quả: theo dõi ổn định của chế phẩm.

+ Sử dụng phương pháp thường quy: nhiệt độ theo dõi (30°C ± 2°C), độ ẩm tương đối: 70% ± 5%.

+ Sử dụng phương pháp lão hóa cấp tốc (nếu thành phẩm có chỉ tiêu định lượng hoạt chất).

Dựa vào kết quả theo dõi độ ổn định đề xuất thời gian sử dụng của thuốc từ dược liệu.

- Báo cáo độ an toàn của chế phẩm (thực hiện theo hướng dẫn ở Chương III Hướng dẫn này).

- Báo cáo tác dụng dược lý của chế phẩm (thực hiện theo hướng dẫn ở Chương III Hướng dẫn này).

Chương III.

HƯỚNG DẪN VỀ NGHIÊN CỨU TIỀN LÂM SÀNG THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

I. HƯỚNG DẪN VỀ TIỀN LÂM SÀNG

1. Động vật nghiên cứu

1.1. Nguồn cung cấp:

- Nguồn cung cấp động vật thí nghiệm giữ vị trí quan trọng trong việc bảo đảm chất lượng của nghiên cứu. Sử dụng động vật của các cơ sở chăn nuôi có uy tín để cung cấp động vật đảm bảo chất lượng cho các phòng thí nghiệm.

- Động vật được kiểm tra chu đáo về mọi mặt như: trọng lượng, lông, màu đuôi, răng, mắt, móng, vú, bộ phận sinh dục ngoài...

- Đảm bảo một nguồn cung cấp động vật ổn định trong suốt quá trình nghiên cứu.

- Nuôi dưỡng và chăm sóc: Động vật nuôi giữ trong điều kiện môi trường thí nghiệm, yên tĩnh, thoáng khí, nhiệt độ từ 20-30°C, độ ẩm 60-75%. Có đủ chuồng để nuôi giữ động vật. Chuồng phải có kích thước phù hợp, có đủ chỗ để thức ăn, nước uống, thoáng, sạch sẽ, dễ làm vệ sinh.

Những loài nhỏ như chuột nhắt có thể nuôi nhốt theo từng nhóm tương ứng với các mức liều thử, động vật lớn cần nuôi giữ từng con. Động vật cần được lưu giữ trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 2 ngày (với động vật nhỏ) hoặc 5 ngày (với động vật lớn) trước khi thí nghiệm.

1.2. Chủng loại, giống, tuổi, trọng lượng và các đặc điểm sinh lý:

- Các động vật nghiên cứu thường dùng là chuột nhắt trắng, chuột cống trắng, chuột lang, thỏ, chó, mèo và ếch. Phải xác định chủng loại, giống, trọng lượng và tuổi thích hợp cho mỗi loại thí nghiệm.

- Khi cần thử nghiệm một phương pháp mới, động vật mới hoặc muốn thay đổi động vật thường dùng trong phương pháp kinh điển phải nghiên cứu chu đáo, thận trọng và phải đảm bảo các yêu cầu khoa học.

- Trước mỗi thí nghiệm kiểm tra các đặc điểm sinh lý của động vật thí nghiệm: thân nhiệt, tuyến sữa...

- Trọng lượng của động vật phải cân vào lúc đói, trước thí nghiệm. Nhận động vật thí nghiệm từ các nơi cung cấp, cân nặng cũng phải tính lúc đói.

1.3. Chế độ dinh dưỡng của động vật nghiên cứu:

- Thức ăn của động vật thí nghiệm:

+ Cần có công thức thức ăn hợp lý phù hợp với từng loại động vật, đáp ứng theo yêu cầu của thí nghiệm.

+ Đảm bảo chế độ ăn đồng nhất trong suốt quá trình nghiên cứu.

+ Không dùng thức ăn để tăng trọng nhanh, tránh dùng thức ăn có khả năng ảnh hưởng đến tác dụng của thuốc.

- Tôn trọng giờ cho ăn hàng ngày để không ảnh hưởng đến hấp thụ thuốc và tránh sự căng quá mức của dạ dày. Thường cho uống thuốc vào sáng hôm sau tức là sau khoảng 16 giờ kể từ khi cho ăn bữa cuối cùng của ngày hôm trước.

1.4. Số lượng động vật thí nghiệm.

- Số lượng động vật thí nghiệm được quy định theo từng thí nghiệm. Đảm bảo đủ số lượng cho phép tính được xác suất thống kê có độ tin cậy cao.

- Nghiên cứu cơ quan cô lập: mỗi tiêu bản sinh vật có thể cho một số tiêu bản thí nghiệm.

1.5. Phương pháp chia lô thí nghiệm:

Do thuốc sử dụng trong thí nghiệm ở dạng toàn phần hoặc các phân đoạn nên tác dụng thể hiện trên động vật thí nghiệm thường khó nhận biết. Vì vậy, số lô nghiên cứu tùy thuộc vào dự đoán tác dụng của thuốc. Cách chia lô thí nghiệm được sử dụng phổ biến là:

- Lô trắng không dùng gì cả.

- Lô chứng dùng nước cất hoặc dung môi.

- Lô chứng dương dùng một thuốc kinh điển đã biết tác dụng (nếu có).

- Lô trị cần chia nhiều nhóm khác nhau tùy theo liều lượng thuốc dự đoán tác dụng.

1.6. Phương pháp đánh giá kết quả của thuốc thí nghiệm:

Đánh giá kết quả của thuốc nghiên cứu có thể theo các cách sau:

- So sánh diễn biến giữa các lô thí nghiệm.

- So sánh số liệu thu được trước và sau thí nghiệm ở từng liều thuốc, giữa lô chứng với lô trị.

- Kết quả nghiên cứu thu được chỉ có giá trị đánh giá chính mẫu thuốc đang nghiên cứu, không được phép ngoại suy sang các mẫu thuốc khác.

- Thuốc đông y thường dùng dạng toàn phần hoặc phân đoạn và chủ yếu theo đường uống nên tác dụng chậm. Vì vậy nên có thử nghiệm sàng lọc trước để chọn thời điểm thích hợp đánh giá tác dụng của thuốc.

1.7. Phương pháp thực nghiệm đánh tác dụng:

Phương pháp thực nghiệm quyết định chất lượng của nghiên cứu, cần lựa chọn chính xác trước khi làm thực nghiệm.

- Động vật nguyên vẹn: Tác dụng dược lý của thuốc đông y thường được xác định qua thực tế lâm sàng (trên cơ thể người bệnh). Vì vậy, nên ưu tiên thử nghiệm trên động vật nguyên vẹn khi đánh giá tác dụng của thuốc.

- Các mô và cơ quan cô lập: loại thử nghiệm này nên thực hiện khi cần đánh giá ảnh hưởng của thuốc trên cơ quan đích (ruột cô lập, tim cô lập, mạch cô lập v.v...), đặc biệt để tìm hiểu cơ chế tác dụng của thuốc.

- Nghiên cứu in-vivo và in-vitro.

Nghiên cứu in-vitro dùng để thăm dò tác dụng và sơ bộ cơ chế tác dụng trước khi chuyển sang nghiên cứu in-vivo.

- Nghiên cứu trên mô hình bệnh lý:

+ Là phương pháp nên dùng khi đánh giá tác dụng của thuốc đông y.

+ Có thể thực hiện số mô hình bệnh lý trên động vật đã được áp dụng tại Việt Nam cũng như một số nước trên thế giới

2. Dùng thuốc:

2.1. Đường dùng thuốc:

Nghiên cứu tác dụng và độc tính trên ĐVTN thường được thực hiện theo đường dự kiến dùng cho người hoặc đường mà mẫu nghiên cứu có thể tiếp xúc và gây ảnh hưởng cho người.

Với các chất có thể tiếp xúc và gây ảnh hưởng cho người theo nhiều đường (miệng, hô hấp, ngoài da), việc thử độc tính cần được tiến hành trên các đường dùng tương tự. Liều thử trên động vật cần được tính theo cân nặng tương ứng với từng loại thử nghiệm.

- Đường uống:

Cho động vật uống theo một số cách sau:

+ Đưa thẳng kim đầu tù hoặc các loại xông (sonde) y tế có kích thước thích hợp vào dạ dày;

+ Đưa thuốc qua một dụng cụ thích hợp vào miệng để động vật tự nuốt: áp dụng với các loại động vật lớn (chó, khỉ) khi cho uống các các mẫu thử dạng rắn (thuốc viên);

- Đường tiêm: có thể đưa thuốc qua các đường tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch, phúc mạc hoặc dưới da, tùy theo đường dùng dự kiến trên người. Với dịch thử có thể tích lớn cần được làm ấm trên 37°C trước khi tiêm tĩnh mạch. Dụng cụ tiêm phải đảm bảo vô khuẩn; không dùng chung kim tiêm cho các ĐVTN khác nhau. Khi cần thử ở mức liều cao, có thể tiêm thuốc ở nhiều vị trí (Phụ lục 1).

2.2. Số lần dùng thuốc:

Số lần cho thuốc nhiều hay ít tùy thuộc vào quy trình của từng nghiên cứu cụ thể.

- Độc tính cấp: mỗi ĐVTN được cho liều thử duy nhất dùng một lần. Khi mức liều khá lớn, có thể chia thành liều nhỏ, dùng 2 - 3 lần trong ngày. Khoảng cách giữa các lần cho uống nên cách nhau ít nhất là 2 giờ; cho động vật ăn sau khi thử liều thứ 2. Nên bố trí số lần dùng và khoảng cách phù hợp để thuận tiện cho quá trình thử nghiệm và theo dõi, không nên cho dùng quá 4 lần trong vòng 24 giờ.

- Độc tính bán trường diễn và độc tính trường diễn: chế độ cho liều thử và thời gian thử nghiệm nói chung sẽ được tính theo thời gian dự kiến sử dụng trên người (xem phụ lục 1). Tuy nhiên, cần xem xét từng trường hợp để có thể giảm số lần dùng trong ngày.

2.3. Liều thực nghiệm:

Xác định đúng liều dùng trong thực nghiệm góp phần quan trọng cho sự thành công của thí nghiệm, thường phải căn cứ vào liều có thể gây đáp ứng. Xác định liều thực nghiệm bằng cách tham khảo tài liệu, tính từ liều lâm sàng đã có hoặc dò liều. Dò liều là phương pháp tốt nhất kể cả khi đã có liều thí nghiệm do tài liệu và lâm sàng cung cấp. Tùy trường hợp cụ thể cần dò 3 - 5 liều.

2.4. Thể tích thuốc nghiên cứu cho mỗi lần:

Khi cho động vật dùng thuốc nghiên cứu, mỗi lần có thể cho một liều lượng khác nhau. Thể tích thuốc dùng sẽ tùy thuộc vào đường cho vào cơ thể và loại thuốc thí nghiệm.

Ví dụ: với chuột nhắt trắng uống 0,2 ml/10 gam thể trọng; tiêm dưới da dung dịch nước 0,2 - 0,3 ml, dung dịch dầu 0,1 - 0,2 ml; tiêm màng bụng 1 ml (phụ lục 1).

2.5. Xử lý thuốc thí nghiệm:

- Thuốc đông y có nhiều dạng khác nhau như cao, đơn, hoàn tán, thang, dầu, rượu.

+ Tùy theo đặc tính, thể chất và đường dùng dự định của từng loại mẫu mà thực hiện những cách xử lý mẫu thích hợp. Ưu tiên thử nghiệm mẫu ở trạng thái đúng như dự kiến sẽ dùng trên người, đặc biệt với mẫu thử ở dạng thành phẩm. Điều kiện, kỹ thuật xử lý mẫu phải phù hợp với đường dùng và cách dùng, hạn chế gây những ảnh hưởng tới độ an toàn hay độc tính của mẫu thử.

+ Với các chất lỏng, dùng nguyên mẫu hoặc pha loãng với dung môi thích hợp để được dung dịch thử.

+ Với các chất rắn tan được trong nước, hòa tan mẫu thử trong nước/nước muối sinh lý đến nồng độ thích hợp để thử. Với chất rắn khó tan hoặc không tan trong nước, có thể sử dụng thêm các chất làm tăng độ tan hoặc chất làm tăng tính thấm... để tạo hỗn dịch thử.

+ Khi sử dụng dung môi không phải nước để pha dung dịch hoặc các chất phụ để tạo hỗn dịch, cần chọn các chất không có tương tác với thành phần có trong mẫu thử; các chất này cũng yêu cầu cần có đủ thông tin về độc tính. Lượng dung môi, chất phụ được sử dụng phải nằm trong giới hạn cho phép về độ an toàn của chất đó. Cần thử song song với nhóm động vật đối chứng dùng các chất này.

+ Với các nguyên liệu hoặc thành phẩm là dược liệu được dùng theo phương pháp dân gian như sắc, chiết, chế với nước... thì tiến hành xử lý mẫu như hướng dẫn dự kiến dùng cho người. Trường hợp lượng dịch chiết quá loãng, thể tích dùng thích hợp trên động vật không có ý nghĩa, có thể phải cô đặc để tăng liều dùng. Điều kiện cô đặc phải thực hiện theo những quy định về bào chế đông y (cô cách thủy, nhỏ lửa), hạn chế những tác động gây ảnh hưởng, biến tính chất độc có trong mẫu thử.

+ Trường hợp mẫu thử ở dạng rắn khó tan, khó phân tán mà chưa có dự định về các sử dụng hoặc có thể sẽ dùng nhiều cách chế biến, cần chọn phương pháp xử lý mẫu sao cho mẫu đem thử đại diện tốt nhất cho chất cần thử. Có thể sử dụng phương pháp chiết xuất với các dung môi và điều kiện chiết khác nhau như chiết bằng cồn (với độ cồn và nhiệt độ khác nhau), chiết bằng nước nóng (sắc hoặc hãm). Trường hợp chiết bằng dung môi hữu cơ, cần bốc hơi hết dung môi rồi phân tán cắn thu được trong nước để cho động vật uống. Nếu chiết bằng cồn, có thể bốc hơi bớt cồn, xác định độ cồn có trong dịch chiết để có thể dùng dung dịch có độ cồn thấp hơn tương đương với độ cồn thử cho nhóm đối chứng.

- Thao tác cho động vật dùng thuốc phải thành thạo, với dụng cụ thí nghiệm chuyên biệt phù hợp với từng loại động vật.

- Thuốc nghiên cứu phải có hồ sơ thuyết minh. Trong hồ sơ phải xác định rõ các số liệu của lô thuốc như số kiểm soát, số đăng ký, công thức chế phẩm (trừ trường hợp được giữ bí mật), cách dùng, liều lượng, chỉ định, chống chỉ định và hạn dùng.

- Trong một số trường hợp nếu cần thiết nên kiểm tra lại tất cả các khâu liên quan đến thuốc thử như độ cồn, chỉ số khúc xạ, độ pH, độ ẩm v.v... trước khi tiến hành nghiên cứu.

- Thuốc nghiên cứu nên thử nghiệm ngay sau khi nhận về, ngay sau khi mở bao bì. Thuốc phải được bảo quản đúng quy cách trong suốt quá trình thí nghiệm, nếu phát hiện thấy biến chất cần cân nhắc xem xét và có thể phải hủy thuốc. Với thuốc dạng rắn, thử nghiệm đến đâu xử lý đến đấy; với thuốc dạng lỏng chỉ lấy đủ số lượng cho mỗi lần thử, thuốc còn thừa phải hủy ngay sau mỗi lần động vật dùng. Với thuốc dạng cồn, chỉ mở bao bì khi bắt đầu thử nghiệm và chỉ nên dùng thuốc trong ngày. Phải bảo quản tốt độ cồn, không để độ cồn khi thử đã giảm nhiều so với ban đầu.

- Kết quả thí nghiệm phải trả lời với thuốc ở dạng nguyên phẩm sẽ sử dụng ở lâm sàng và gửi đến để nghiên cứu tiền lâm sàng.

3. Điều kiện môi trường thí nghiệm

- Vi khí hậu có ảnh hưởng lớn đến tác dụng của thuốc, đặc biệt đối với một số thuốc đông y. Cần có biện pháp chủ động khống chế vi khí hậu trong phòng thí nghiệm như dùng máy điều hòa nhiệt độ hoặc sử dụng các biện pháp thông thường để tăng, giảm nhiệt độ trong phòng thí nghiệm, ví dụ làm ấm bằng lò sưởi..., hoặc tiến hành thí nghiệm vào các mùa xuân, thu, bắt đầu từ 8 giờ sáng v.v..

- Lưu ý các đặc điểm sinh lý của động vật theo mùa để đề ra kế hoạch nghiên cứu thích hợp trong năm.

II. HƯỚNG DẪN VỀ KHẢO SÁT TÍNH AN TOÀN CỦA THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

Khảo sát độc tính của thuốc đông y bao gồm:

- Thử nghiệm về độc tính cấp diễn.

- Thử nghiệm về độc tính bán trường diễn và trường diễn.

- Thử nghiệm về độc tính tại chỗ.

- Thử nghiệm về độc tính đặc biệt: trên sinh sản, biến đổi di truyền, khả năng gây ung thư...

1. Thử nghiệm về độc tính cấp diễn:

1.1. Mục tiêu: Thử độc tính cấp nhằm cung cấp thông tin cho việc xếp loại mức độ độc của thuốc, dự đoán triệu chứng và dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc cấp; thiết lập mức liều cho những thử nghiệm độc tính và tác dụng cũng như phạm vi an toàn của thuốc nghiên cứu tiếp theo. Do vậy, các phép thử độc tính cấp cần xác định.

a) Liều an toàn;

b) Liều dung nạp tối đa;

c) Liều gây ra độc tính có thể quan sát được;

d) Liều thấp nhất có thể gây chết động vật thí nghiệm (nếu có);

e) Liều LD50 gần đúng (nếu có thể xác định được);

f) Những triệu chứng ngộ độc điển hình có thể quan sát được trên động vật và khả năng hồi phục (nếu có).

1.2. Mô hình thử

a) Nguyên tắc lựa chọn:

- Tùy theo mục đích của mỗi nghiên cứu và loại mẫu thử và những thông tin sẵn có để lựa chọn mô hình thử thích hợp. Loài động vật gặm nhấm thường được sử dụng là chuột nhắt, chuột cống; loài không gặm nhấm có thể dùng là chó hoặc khỉ. Số nhóm và số lượng cho mỗi nhóm tùy theo mô hình áp dụng.

- Thử sơ bộ: thường được thực hiện trong hầu hết các mô hình thử. Dựa vào kết quả trong thử nghiệm sơ bộ để lựa chọn, bố trí thử nghiệm chính thức. Với những trường hợp thông tin cho thấy mẫu thử hoặc các chất liên quan có thể không độc hoặc ít độc, có thể thử trên một loài động vật (gặm nhấm). Đối với các chế phẩm có độc cao hoặc có yêu cầu đặc biệt về khoa học, cần thiết thử trên hai loài ĐVTN (gặm nhấm và không gặm nhấm).

- Khuyến cáo: Để bảo vệ động vật, các mô hình sử dụng số ít động vật thí nghiệm được ưu tiên lựa chọn.

b) Mô hình liều cố định:

Nguyên tắc: Mô hình thử liều cố định được các nước thuộc OECD áp dụng và ban hành chính thức năm 2001 (OECD 420 [5]). Thử nghiệm được thực hiện với các mức liều xác định 5, 50, 300, 2000, 5000mg/kg hay 1,0/kg ĐVTN. Lựa chọn liều thử đầu tiên liều thử trên một nhóm 5 ĐVTN. Thử nghiệm tiếp tục cho đến khi xác định mức độ độc dựa trên đáp ứng ĐVTN chết hoặc không và các triệu chứng ngộ độc, khả năng hồi phục quan sát được. Xác định giá trị LD50 gần đúng (nếu có). Phép thử phù hợp với tất cả trường hợp cần xác định độc tính cấp.

Thử nghiệm chính thức

- Mức liều khởi đầu trong thử nghiệm chính thức được xác định từ thử nghiệm sơ bộ, thường là mức liều bắt đầu quan sát được các triệu chứng ngộ độc. Không dùng các mức liều đã gây chết trong giai đoạn thử sơ bộ để khởi đầu trong thử nghiệm chính thức.

- Số lượng ĐVTN: 5 con/mức liều (mỗi nhóm), bao gồm cả 01 con đã dùng thử ở thử nghiệm sơ bộ. Thử nghiệm sẽ dừng lại khi có đủ thông tin về các mức liều theo quy định chung. Trung bình cần khoảng 3-4 nhóm động vật, số nhóm mà mức liều thử có thể ít hơn nếu mẫu thử biểu hiện độc tính rõ ràng hoặc không độc.

- Khoảng thời gian nghỉ giữa các đợt thử ở mức liều khác nhau phải đủ để kết luận ĐTVN dùng nhóm liều trước đó sống sót, thường từ 3-4 ngày. Khoảng thời gian này có thể điều chỉnh cho phù hợp với các trường hợp thí nghiệm.

- Trường hợp mẫu có độc tính cao: khi có 01 ĐVTN dùng liều 5mg/kg bị chết, thử lại trên con vật thứ 2 với mức liều này.

+ Nếu con thứ 2 chết, dừng thử nghiệm, phân loại chất này vào nhóm 1 của GSH.

+ Nếu con thứ 2 còn sống, thử lần lượt thêm nhiều nhất 3 con nữa cùng mức liều 5mg/kg.

+ Nếu có thêm 01 con nữa chết, dừng thí nghiệm (không kể số lượng ĐVTN đã dùng là bao nhiêu), phân loại chất đó vào loại 1 của GSH, nếu không có thêm con nào chết, phân loại chất đó vào loại 2 của GSH.

- Trường hợp mẫu có độc tính thấp hoặc không độc: tiến hành thử với các mức liều tăng dần để xác định được các thông tin và tăng với mức liều giới hạn.

Ghi chép và báo cáo các biểu hiện quan sát được theo quy định chung. Tùy kết quả thử nghiệm và bảng phân loại GSH để xếp loại mức độ độc của mẫu thử. Tiến trình thử và cách xác định giá trị LD50 ước tính được mô tả cụ thể trong sơ đồ 1, 2 (phụ lục 2).

- Thử giới hạn: Khi những thông tin từ các tài liệu, báo cáo đã có và kết quả thử sơ bộ cho phép dự đoán mẫu thử có thể không độc, có nghĩa là chỉ có thể gây độc ở mức liều cao hơn mức liều giới hạn thử thông thường, có thể thực hiện phép thử giới hạn. Tiến hành thử trên lần lượt 5 con vật dùng mẫu thử ở mức liều giới hạn 5,0kg hoặc 10,0g/kg (có thể bao gồm cả 1 con đã thử sơ bộ). Dừng thí nghiệm nếu không quan sát thấy biểu hiện ngộ độc nào ở mức liều này.

c) Mô hình Tăng - Giảm:

Nguyên tắc: Mô hình thử Tăng - Giảm được các nước thuộc OECD (Organization for Economic Co-operation and Development - Tổ chức Hợp tác và Phát triển kinh tế) áp dụng và ban hành chính thức năm 2001 (OECD 425 [6]). Thử nghiệm được tiến hành trên các mức liều được tính theo hệ số bước nhảy liều, thực hiện lần lượt trên từng ĐVTN theo tiến trình tăng hoặc giảm liều và tiếp tục cho đến khi đạt điều kiện dừng lại. Đánh giá kết quả bằng quan sát các biểu hiện và triệu chứng ngộ độc theo quy định chung và tính giá trị LD50 gần đúng (nếu có) theo quy định riêng của phương pháp.

Phương pháp này áp dụng phù hợp cho các chất có thể gây chết nhanh trong 1-2 ngày không phù hợp cho các chất gây chết từ từ trong 5 ngày hoặc hơn. Ngoài ra, có thể áp dụng phương pháp này trong trường hợp cần thử trên loài động vật không gặm nhấm.

Thử nghiệm chính thức.

- Xác định mức liều thử: các mức liều thử được chọn với hệ số bước nhảy liều là giá trị antilog của 1/độ dốc ước tính (của đường cong liều - đáp ứng). Có thể chọn các mức liều bằng cách sử dụng bảng liều đã tính sẵn theo nguyên tắc trên được ghi trong Bảng 1. Liều khởi đầu là mức liều thấp hơn gần nhất với mức liều LD50 ước tính. Tùy theo mức độ độc dự đoán mà lựa chọn mức liều khởi đầu và cấp số liều với giá trị độc dốc nhỏ; ngược lại, với chất có độc cao, chọn giá trị độ dốc lớn. Khi không có thông tin về liều gây chết của mẫu thử, mức liều khởi đầu thường chọn 175mg/kg bước nhảy liều chọn ứng với giá trị độ dốc là 2 (tức là hệ số bước nhảy liều là 3,2) (tham khảo Bảng 3, phụ lục 2).

- Khoảng thời gian nghỉ giữa các mức liều phải đủ để kết luận ĐVTN dùng nhóm liều trước đó sống sót, thường là 48 giờ, có thể thay đổi tùy trường hợp.

- Tiến hành thử nghiệm trên từng con vật theo các mức liều đã xác định trong khoảng thời gian đủ để quan sát và xác định tình trạng sống/chết của con vật. Quan sát và ghi chép những thông tin theo quy định chung.

- Dừng thử nghiệm khi thỏa mãn một trong các điều kiện sau:

+ 3 ĐTVN liên tiếp sống sót ở mức liều giới hạn trên (2,0/g; 5,0/g hoặc 10g/kg).

+ Có 5 cặp đảo ngược trong 6 ĐVTN đã thử liên tiếp.

+ Có ít nhất 4 ĐVTN được thử sau khi xuất hiện cặp đảo ngược đầu tiên và giá trị tỷ lệ li tính được vượt qua giới hạn cho phép.

- Quan sát và ghi chép tất cả những biểu hiện ngộ độc có thể quan sát được. Tính giá trị LD50 gần đúng theo kết quả quan sát được về tình trạng của các con vật tại thời điểm dừng (phụ lục 2). Việc tính toán dễ thuận lợi hơn khi sử dụng các phần mềm (SAS, BMDP). Trong một số trường hợp, giá trị LD50 tính được coi là gần đúng (ước tính).

Thử nghiệm giới hạn: Khi người làm thí nghiệm có thông tin cho thấy mẫu thử có thể không độc, tức là chỉ có thể gây độc ở mức liều cao hơn giới hạn thử thông thường thì có thể áp dụng thử nghiệm giới hạn. Thử giới hạn ở một trong các mức liều 2,0g/kg hoặc 5,0g/kg hoặc 10g/kg (với các thuốc có nguồn gốc thực vật).

Tiến hành theo các bước như sau:

- Cho con thứ nhất uống mẫu thử ở mức liều giới hạn đã chọn. Nếu con đó chết thì tiến hành thử nghiệm chính thức để xác định LD50.

- Nếu con đó sống sót, cho lần lượt 4 con nữa dùng mẫu thử.

- Nếu có 3 con chết thì dừng thử nghiệm giới hạn, tiến hành thử nghiệm chính thức theo nguyên tắc giảm liều. Trong trường hợp này, LD50 nhỏ hơn mức liều giới hạn.

- Nếu có ít nhất 3 con sống thì LD50 lớn hơn mức liều giới hạn đã thử, dừng thử nghiệm và theo dõi tiếp cho đủ thời gian quy định hoặc tiến hành thử nghiệm chính thức ở các mức liều cao hơn để tính được giá trị LD5 nếu thấy cần thiết hoặc giảm để xác định mức liều không gây triệu chứng ngộ độc gì.

d) Mô hình thử theo Behrens:

Nguyên tắc: Mô hình được Behrens đề xuất từ năm 1929 [2] với lập luận “Những con vật đã sống ở một mức liều thử nào đó thì sẽ sống với tất cả những mức liều thấp hơn và những con vật đã chết ở một mức liều sẽ chết ở tất cả các mức liều cao hơn”.

Tiến hành: Thí nghiệm được bố trí với các nhóm động vật, mỗi nhóm được dùng một mức liều, khoảng cách giữa các liều thử nghiệm phải bằng nhau và số động vật thí nghiệm trong các nhóm bằng nhau. Số nhóm thử được bố trí sao cho thu được các số liệu đủ để tính kết quả, trong đó có ít nhất 1 nhóm không có ĐVTN nào bị chết, và một nhóm có tối thiểu 80% số ĐVTN bị chết, và có ít nhất 2 nhóm thử với 2 mức liều cho kết quả tương ứng giữa 2 mức liều trên.

Tính giá trị LD50 theo quy định của phương pháp (phụ lục 2.3)

e) Mô hình theo Litchfield - wilcoxon:

Nguyên tắc: Mô hình được Litchfield- Wilcoxon đề xuất năm 1949 sau khi xem xét, cải tiến và cố gắng khắc phục những hạn chế của một số phương pháp trước đó. Kết quả được ghi đồ thị trên giấy log- probit và được tính theo phương pháp toán đồ có hiệu chỉnh, do vậy cho kết quả chính xác hơn. Trước đây, phương pháp thường được áp dụng trong tính giá trị LD50 cho những chất có độc tính cao.

Tiến hành:

- Động vật thường dùng là chuột nhắt trắng, cả 2 giống, trọng lượng 20 ± 2g, được chia thành từng lô, mỗi lô 10 con. Số lượng khoảng 100 con.

- Cho từng lô chuột uống thuốc thử với các liều khác nhau từ liều cao nhất không gây chết tới liều thấp nhất gây chết 100% chuột. Chuột được uống thuốc bằng kim hơi cong có đầu tù với độ dài đưa vào đến dạ dày chuột.

- Chuột được nhịn ăn 12 giờ trước khi uống thuốc, vẫn uống nước đầy đủ.

- Theo dõi số chuột chết trong 72 giờ đầu và tình trạng chung của chuột trong 7 ngày sau khi uống thuốc về sự ăn uống, hoạt động thần kinh, đi lại, leo trèo, bài tiết,....

- Nếu chuột chết, mổ chuột để đánh giá đại thể các tổn thương của các cơ quan, nếu cần thiết có thể làm xét nghiệm vi thể một số phủ tạng.

Tính giá trị LD50 theo quy định của phương pháp (phụ lục 2.4).

1.3. Theo dõi, đánh giá.

Theo dõi ĐVTN trong vòng 7 ngày sau khi dùng thuốc. Thời gian theo dõi có thể ngắn hơn (5 ngày) nếu thấy các biểu hiện ngộ độc đã hết, hoặc kéo dài hơn (14 ngày) nếu biểu hiện ngộ độc chưa rõ ràng hoặc cần theo dõi thêm về khả năng hồi phục. Ghi chép và mô tả bất kì triệu chứng, biểu hiện khác thường nào của ĐVTN, nếu có.

Các chỉ tiêu cần quan sát bao gồm.

- Tình trạng hoạt động, khả năng tiêu thụ thức ăn, nước uống, tình trạng phân, nước tiểu.

- Trọng lượng cơ thể: xác định trọng lượng trước khi kết thúc thí nghiệm.

- Biểu hiện độc cấp tính đặc biệt ngay sau khi dùng thuốc, những biểu hiện bất thường trên thần kinh, vận động như hành vi, cử động, đi lại, co giật, biểu hiện của các chức năng hô hấp, tuần hoàn, tiêu hóa như nhịp tim, nhịp thở, nôn mửa, phản xạ của giác quan như mắt mũi, biểu hiện tình trạng chất bài tiết, long ....của ĐVTN. Chú ý phân biệt với các biểu hiện do tác dụng dược lý của thuốc (an thần, gây ngủ, hạ huyết áp...).

- Xác định số lượng ĐVTN có biểu hiện ngộ độc; thời gian bắt đầu thể hiện triệu chứng độc, thời gian kéo dài các triệu chứng, khả năng hồi phục.

- Số lượng ĐVTN bị chết (nếu có) thời gian chết ứng với mỗi mức liều đã thử.

- Chết tiên đoán. Những ĐVTN ở tình trạng suy kiệt, hấp hối kéo dài, không có khả năng sống sót (ĐVTN không thể ăn uống trong khoảng thời gian theo dõi, được tiên đoán là sẽ chết), thì được tính như là trường hợp ĐVTN bị chết.

1.4. Quan sát và phân tích mô bệnh học

Mổ để quan sát đại thể những động vật bị chết trong thời gian theo dõi. Nếu quan sát trên đại thể thấy những biểu hiện bất thường, làm tiêu bản vì thế để quan sát rõ hơn nếu có điều kiện.

1.5. Báo cáo

Báo cáo kết quả cần ghi rõ và đủ các thông tin:

Động vật thí nghiệm:

- Loài/ chủng đã dùng;

- Số lượng, tuổi, giống;

- Nguồn gốc, điều kiện chăm sóc, chế độ ăn;

- Cân nặng khi bắt đầu và khi kết thúc thí nghiệm đối với những động vật còn sống sót hay cân nặng của con vật khi chết.

Điều kiện, phương pháp mẫu thử:

Chi tiết về mẫu thử, nồng độ, độ ổn định, tính đồng nhất của mẫu thử:

- Mô tả phương pháp xử lý chuẩn bị mẫu thử. Trong trường hợp có sử dụng các chất phụ, dung môi không phải là nước cất để hòa tan hay phân tán mẫu, cần có giải thích rõ ràng;

- Nguyên tắc chọn liều thử;

- Các mức liều thử nghiệm (tính theo gam hoặc ml mẫu thử/kg thể trọng động vật/ngày);

- Mô tả về cách cho động vật dùng mẫu thử;

- Quy định về lượng thức ăn, nước uống hàng ngày của ĐVTN;

- Mô tả cách tiến hành quan sát đại thể đối với những ĐVTN bị chết;

- Mô tả các chỉ tiêu cần đánh giá khi mổ quan sát đại thể;

- Mô tả phương pháp hoặc ghi tên cơ sở làm tiêu bản vi thể, các chỉ tiêu cần đánh giá, phương pháp đánh giá (nếu có);

- Trường hợp xác định LD50, cần nêu rõ phương pháp xác định.

Kết quả:

- Trọng lượng cơ thể hoặc mức độ thay đổi;

- Tiêu thụ thức ăn, nước uống;

- Mô tả chi tiết những biểu hiện bất thường (ngộ độc) quan sát được;

- Mô tả khả năng, dấu hiệu, thời gian hồi phục (nếu có);

- Kết quả quan sát đại thể;

- Kết quả quan sát tiêu bản vi thể (nếu có);

- Xử lý thống kê kết quả thử nghiệm (nếu có);

- Bàn luận về kết quả thử nghiệm (nếu có).

Kết luận: kết luận cần nêu lên các dự liệu quan sát được trong thử nghiệm:

- Liều an toàn, liều dung nạp tối đa;

- Liều tối thiểu gây chết (nếu có);

- Liều LD50 gần đúng (nếu xác định được);

- Các mức liều gây ra triệu chứng ngộ độc điển hình quan sát được;

- Các triệu chứng ngộ độc điển hình quan sát được (nếu có);

- Khả năng hồi phục.

Chú ý: Kết luận về mức độ độc ngoại suy sang người của mẫu thử được xác định bởi một Hội đồng khoa học sau khi xem xét một cách khách quan tất cả các thông tin về kết quả thử nghiệm, tài liệu về mẫu thử và mục đích sử dụng.

1.6. Một số vấn đề cần lưu ý:

- Khi đánh giá độc tính của một thuốc đông y trước khi thử nghiệm lâm sàng, không nên chỉ dựa vào LD50, mà phải quan tâm đến các tác dụng phụ không có lợi.

- Không nên so LD50 của thuốc đông y được nghiên cứu với LD50 của các thuốc đông y khác không được tiến hành trong cùng điều kiện thí nghiệm.

- Không nên so LD50 của thuốc đông y với LD50 của thuốc tân dược là hoạt chất của thuốc đông y như so LD50 của phụ tử với LD50 của Aconitin, LD50 của mã tiền với LD50 của Strychnin.

2. Thử nghiệm về độc tính bán trường diễn:

2.1. Mục tiêu:

Thử độc tính dài ngày chỉ được tiến hành sau khi đã có thông tin về độc tính cấp trên động vật và mẫu thử được dự định sử dụng hoặc tiếp xúc dài ngày trên người.

Thử độc tính dài ngày nhằm xác định khả năng dung nạp của động vật thí nghiệm khi dùng mẫu thử nhiều lần. Thông tin cần xác định có những biểu hiện độc tính sau khi dùng dài ngày, bao gồm:

- Mức liều không hoặc có gây thay đổi đáng kể tới chức năng, cơ quan hoặc một số biểu hiện sống có thể quan sát được trên động vật thí nghiệm;

- Những độc tính có thể quan sát được trên động vật và khả năng hồi phục nếu có.

2.2. Lựa chọn mô hình thử:

Căn cứ vào các thông tin của mẫu thử và kết quả thử độc tính cấp để thiết kế mô hình, mức liều thử.

- Trường hợp mẫu thử không thể hiện độc tính cấp hoặc rất ít độc, có thể thử trên 1 loài động vật (gặm nhấm).

- Trường hợp mẫu thử thể hiện độc tính cấp cao, liều gây độc gần với liều có tác dụng dược lý, cần thiết thử trên 2 loài động vật (gặm nhấm và không gặm nhấm).

2.3. Thời gian thử:

Thời gian thử trên động vật được tính dựa theo thời gian dự kiến dùng trên người hoặc có thể thử với các khoảng thời gian xác định. Ngoài ra, thời gian thử còn phụ thuộc vào đích của thử nghiệm là cung cấp thông tin cho thử lâm sàng giai đoạn nào. Khi cần thông tin cho thử lâm sàng giai đoạn 1 hoặc 2, thời gian có thể ngắn hơn (14-28 ngày); khi cần cung cấp thông tin cho thử lâm sàng giai đoạn 3, thời gian thử cần dài hơn (28-90 ngày). Hiện nay, tài liệu hướng dẫn của các nước tham gia hòa hợp ICH giới thiệu tính thời gian thử độc tính theo 2 cách:

- Thời gian thử thuốc bằng 3-4 lần thời gian dự kiến dùng trên người.

- Thời gian thử theo từng khoảng xác định: 14 ngày, 28 hoặc 90 ngày. Lựa chọn từng khoảng thời gian thử tùy theo yêu cầu từng mẫu và điều kiện thử nghiệm.

Đánh giá mức độ độc sẽ được xem xét trên báo cáo kết quả tương ứng với từng khoảng thời gian đã thử.

2.4. Liều dùng:

Thuốc được dùng chủ yếu qua đường uống bằng dụng cụ chuyên biệt.

Mức liều thử phải được lựa chọn sao cho có ý nghĩa trong việc đánh giá về khả năng an toàn hay mức độ gây độc của mẫu thử khi dùng nhiều ngày trên động vật. Mức liều thử thường được tính từ các thông tin thu được từ thử độc tính cấp, và được quy đổi tương đương theo liều giữa các loài nếu thử trên loài khác nhau (phụ lục 1). Với những nghiên cứu đầy đủ, thử nghiệm được thiết kế với 3 mức liều (tương đương 3 nhóm thử):

- Liều thấp: mức liều đủ để mẫu thử có tác dụng dược lý hoặc điều trị (tức là tương đương mức liều dự kiến dùng để điều trị cho người);

- Liều trung bình: mức liều có thể không gây những độc tính quan sát được hoặc gây ảnh hưởng không đáng kể;

- Liều cao: mức liều dự kiến sẽ quan sát được biểu hiện ngộ độc trên cơ quan của ĐVTN hoặc đến mức thể tích giới hạn cao nhất mà ĐVTN có thể dùng được.

Thử nghiệm nên được tiến hành song song với 1 nhóm chứng trong cùng điều kiện với cùng số lượng động vật đã dùng trong nhóm thử. Tuy nhiên, trong thời điểm hiện tại phần lớn các nghiên cứu có thể chấp nhận với 1 nhóm chứng và 2 nhóm thử (liều thấp và liều cao).

Cho động vật dùng thuốc hàng ngày, 7 ngày/tuần, trừ khi có chế độ liều đặc biệt.

Số động vật trên mỗi nhóm tùy theo loài 8-10 con (gặm nhấm); hoặc 2-4 con (không gặm nhấm). Việc dùng các động vật không gặm nhấm thường rất tốn kém, đặc biệt là các loài linh trưởng. Khi cần thử nghiệm trên động vật không gặm nhấm, đề cương cần được xem xét bởi Hội đồng khoa học hoặc khi có yêu cầu của cơ quan quản lý hoặc nhà sản xuất.

2.5. Theo dõi, đánh giá

Quan sát trên tất cả các ĐVTN đã dùng trong thử nghiệm, ghi chép các thông số quan sát được của từng ĐVTN khi xem xét.

Chỉ tiêu quan sát: theo dõi hàng ngày về tình trạng sức khỏe, khả năng tiêu thụ thức ăn, nước uống, tình trạng phân, nước tiểu của ĐVTN.

- Trọng lượng: xác định trọng lượng khi bắt đầu, hàng tuần và kết thúc thí nghiệm.

- Xét nghiệm các chỉ số huyết học và sinh hóa nên thực hiện vào cuối kỳ khi kết thúc thí nghiệm. Một số trường hợp cần thiết thì xét nghiệm để so sánh trước và sau thí nghiệm.

+ Huyết học: số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hematocrit, hemoglobin.

+ Sinh hóa: ALT, AST, creatinin, protein toàn phần, albumin, glucose huyết, cholesterol, bilirubin.

+ Có thể xét nghiệm thêm một số chỉ số khác nếu cần như nồng độ kali, natri trong máu, gama glutamyl transpeptidase, các enzyn gan khác, chức năng các tuyến... tùy theo khả năng gây độc của mẫu thử.

- Quan sát và mô tả các biểu hiện bất thường của ĐVTN, đặc biệt liên quan tới các chức năng hô hấp, tuần hoàn, tiêu hóa, (nhịp thở, nhịp tim, tình trạng nôn mửa, ỉa chảy, sủi bọt mép); trên thần kinh, vận động như hành vi, cử động, đi lại, co giật; phản xạ của các giác quan như nhắm mắt, mũi của con vật. Cần có những quan sát đánh giá để phân biệt các triệu chứng ngộ độc với những biểu hiện do tác dụng dược lý của thuốc (an thần, gây ngủ, hạ huyết áp...).

- Phân tích mô bệnh học: mổ những con vật chết trong quá trình nghiên cứu và những con còn sống khi kết thúc thí nghiệm để quan sát đại thể các tổ chức, ưu tiên các tổ chức gan, thận và cơ quan đích tác dụng của thuốc. Quan sát, đánh giá các biểu hiện về màu sắc, hình dạng của các tổ chức. Nếu thấy biểu hiện khác thường so với nhóm chứng (bỏ câu này vì nhiều tổn thương vi thể không biểu hiện trên đại thể), cần quan sát trên vi thể để kiểm tra các biến đổi trên mô học. Trong điều kiện hiện nay cần kiểm tra vi thể 100% những động chết trong khi thử và xác suất 30-50% số động vật ở mỗi lô sau khi kết thúc nghiên cứu. Đánh giá những biến đổi trên vi thể phải được thực hiện ở các phòng thí nghiệm chuyên ngành có kinh nghiệm.

- Khi cần theo dõi khả năng hồi phục, phải bổ sung số ĐVTN muốn giữ lại để theo dõi (sau khi hết thời gian dùng thuốc). Với cơ quan đã thấy bị tổn thương ở nhóm thử, cần xét nghiệm mô bệnh học trên cơ quan đó ở nhóm phụ để đánh giá khả năng hồi phục được rõ hơn.

Đánh giá: với các giá trị xác định được biểu thị bằng số, lập bảng tóm tắt các kết quả của cả nhóm và tính thống kê giá trị trung bình. So sánh kết quả của nhóm thử so với nhóm chứng theo thống kê (test 1- student), hoặc phương pháp thích hợp với các chi tiết không biểu thị bằng số.

2.6. Báo cáo: báo cáo kết quả cần ghi rõ và đủ các thông tin:

Động vật thí nghiệm:

- Loài/chủng đã dùng;

- Số lượng, tuổi, giống;

- Nguồn gốc, điều kiện chăm sóc, chế độ ăn.

Điều kiện, phương pháp thử:

- Chi tiết về mẫu thử, nồng độ, độ ổn định, tính đồng nhất của mẫu thử;

- Dung môi pha mẫu thử, chú ý giải thích nếu dùng dung môi khác không phải là nước;

- Chuyển đổi từ nồng độ chất thử/dung dịch cho uống hoặc thức ăn ra liều thực đã dùng (mg/kg thể trọng/ngày);

- Nguyên tắc chọn mức liều thử;

- Mô tả cách cho động vật dùng mẫu thử;

- Quy định lượng thức ăn, nước uống hàng ngày;

- Tình trạng, mức độ và thời gian quan sát lâm sàng (có quan sát hồi phục không);

Kết quả:

- Trọng lượng cơ thể khi bắt đầu, kết thúc/thay đổi;

- Tiêu thụ thức ăn, nước uống;

- Đánh giá về tình trạng sức khỏe, mức độ hoạt động;

- Kết quả theo dõi và xử lý thống kê về thông số huyết học, sinh hóa;

- Những dấu hiệu ngộ độc quan sát được;

- Kết quả quan sát đại thể;

- Kết quả quan sát vi thể, dấu hiệu bệnh lý trên các tổ chức, nếu có.

Kết luận.

Chỉ nên kết luận dựa trên các dữ liệu quan sát được. Kết luận về mức độ độc, ngoại suy sang người nên do Hội đồng khoa học xác định sau khi xem xét một cách khách quan tất cả các thông tin về kết quả thử nghiệm, tài liệu về mẫu thử và mục đích sử dụng.

3. Thử nghiệm về độc tính tại chỗ:

Áp dụng với các thuốc có khả năng gây mẫn cảm da

3.1. Các chế phẩm thuốc dùng trị bệnh ngoài da cần phải thử bao gồm: các chế phẩm rắn (chuẩn bị để thử nghiệm bằng cách làm ướt chế phẩm với nước hay một dung môi thích hợp để có một dạng đồng nhất khi đắp vào da), chế phẩm mềm, chế phẩm lỏng.

3.2. Động vật thí nghiệm: sử dụng các loại có tính mẫn cảm cao. Loài chuột lang được coi là động vật thích hợp nhất.

3.3. Phương pháp thử nghiệm:

Ở nước ta các phương pháp thử nghiệm thường dùng là

- Thử nghiệm bằng trợ chất và bằng gạc có tẩm thuốc.

- Thử nghiệm với trợ chất Freund toàn bộ.

- Thử nghiệm trên da mở (open epicutaneous test)

3.4. Đánh giá các kết quả thử nghiệm.

Phản ứng da của động vật thử nghiệm được đánh giá theo quy chuẩn của từng phương pháp nghiên cứu đã dùng.

4. Các thử độc tính đặc biệt.

Nghiên cứu đánh giá thuốc đông y thường ít sử dụng các thử nghiệm độc tính đặc biệt vì trên thực tế, thuốc đông y dùng theo đúng kinh điển đã được chứng minh qua nhiều thế hệ là an toàn, chưa thấy xuất hiện độc tính đặc biệt. Tuy vậy, trong một số trường hợp nếu cần thiết nên khảo sát độc tính đặc biệt của một số thuốc nghi có độc tính (ví dụ thạch tín, cây vòi voi...)

Trong điều kiện thực tế hiện nay, các thử nghiệm có thể tiến hành như:

- Thí nghiệm về gây đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể tế bào tủy xương và tinh hoàn.

- Thí nghiệm về khả năng gây ung thư.

- Thí nghiệm độc tính trên sinh sản: gây sẩy thai, đẻ non, chết thai... .

5. Yêu cầu về dữ liệu của tính hiệu quả và tính an toàn và dược lực học của nghiên cứu tiền lâm sàng

5.1. Tính hiệu quả

Tính hiệu quả được thể hiện khi phân tích các kết quả nghiên cứu trong ống nghiệm và trên động vật, nên tham khảo các tài liệu trong y văn hoặc trên các tạp chí khoa học khi khẳng định về hiệu quả của thuốc đông y.

5.2. Tính an toàn

Phải có đầy đủ các dữ liệu về độc tính của thuốc đông y trước khi thử nghiệm trên người.

6. Hướng dẫn áp dụng:

Hướng dẫn này giới thiệu những quy định chung nhất khi tiến hành thử nghiệm. Tùy thuộc vào từng loại mẫu thử và những thông tin sẵn có, thiết kế thử nghiệm có thể khác nhau. Những thiết kế đặc biệt, những thử nghiệm giới hạn hay mở rộng, sâu hơn, cần phải được giải thích rõ và đề cương phải được thông qua bởi một Hội đồng khoa học và đạo đức. Bên cạnh đó, khi có điều kiện cần thực hiện đánh giá độc tính đặc biệt (trên sinh sản, khả năng gây ung thư), hoặc nghiên cứu động học về độc tính, độc tính trên các tổ chức, chức năng của cơ thể sống.

- Nguyên liệu (dược liệu):

+ Với những cây cỏ mới được phát hiện, nghiên cứu để dùng làm thuốc, chưa có tài liệu hay một kinh nghiệm sử dụng nào trong dân gian, cần tiến hành các nghiên cứu đầy đủ như hướng dẫn. Nếu kết quả nghiên cứu độc tính cấp cho thấy mẫu nghiên cứu không độc hoặc rất ít độc, thì thử nghiệm bán cấp có thể giảm bớt số nhóm thử.

+ Với những dược liệu chưa được nghiên cứu dùng làm thuốc, nhưng đã có tài liệu về sử dụng trên người, động vật hoặc trên thực tế đã có kinh nghiệm sử dụng trong dân gian làm thuốc, thực phẩm...thì tùy theo mức độ thông tin, có thể giảm bớt thời gian nghiên cứu hoặc số nhóm trong nghiên cứu.

- Thành phần:

+ Chế phẩm dược bào chế theo công thức, phương pháp bào chế cổ truyền, đã có tài liệu và kinh nghiệm sử dụng trong thực tế: tùy theo mức độ an toàn của các vị thuốc thành phần có trong chế phẩm mà có thể xem xét miễn thử hoặc giảm bớt các nhóm thử, rút ngắn thời gian thử.

+ Chế phẩm có công thức tương tự một bài thuốc cổ truyền nhưng bào chế theo phương pháp hiện đại: tùy theo tính an toàn của các vị thuốc thành phần và kỹ thuật bào chế mới mà xem xét để có thể giảm bớt các thử nghiệm.

+ Với các chế phẩm, chỉ thử trên nguyên dạng của mẫu thử hoặc theo cách chế biến, xử lý như dự kiến sẽ dùng cho người; không nên chiết xuất với các dung môi rồi cô đặc để nâng cao liều thử nhằm mục đích xác định giá trị LD50.

Việc miễn thử hoặc giảm bớt nội dung thử phải do một Hội đồng khoa học và đạo đức xem xét và được phép bởi cơ quan có thẩm quyền quyết định.

Chương IV.

HƯỚNG DẪN THỬ NGHIỆM LÂM SÀNG THUỐC ĐÔNG Y, THUỐC TỪ DƯỢC LIỆU

Ở Việt Nam, Bộ Y tế có Thông tư 03/2012/TT-BYT Hướng dẫn về thử thuốc trên lâm sàng phục vụ cho việc nghiên cứu thử nghiệm các loại thuốc hóa dược, sinh phẩm y tế, vắc xin và thuốc đông y, thuốc từ dược liệu sử dụng trong chẩn đoán, điều trị và phòng bệnh cho cộng đồng.

1. Các giai đoạn đánh giá hiệu quả lâm sàng

Được tiến hành sau khi đã hoàn thành hồ sơ tiền lâm sàng.

1.1. Giai đoạn 1:

a) Mục đích: Nghiên cứu được tiến hành trên người tình nguyện đáp ứng đủ tiêu chuẩn thử nghiệm lâm sàng với mục đích xác định liều dung nạp tối đa (là liều tối đa mà với liều đó không gây ra những tác dụng phụ nghiêm trọng).

b) Liều: Liều đầu tiên phải bằng 1/3 đến 1/5 liều dự kiến từ nghiên cứu tiền lâm sàng. Từ liều đầu tiên đến liều tối đa có thể chia làm nhiều liều. Giai đoạn này kết thúc khi xác định được liều an toàn.

c) Cỡ mẫu: cỡ mẫu cần cân nhắc thận trọng dựa trên kết quả nghiên cứu tiền lâm sàng, trong khoảng từ 10 đến 30 đối tượng.

d) Những điểm cần lưu ý: Nghiên cứu giai đoạn 1 được thực hiện để đánh giá tính an toàn của thuốc trên người tình nguyện khỏe mạnh ở các liều tăng dần, từ đó làm tiền đề cho giai đoạn 2 và giai đoạn 3. Ngoài ra, các thử nghiệm giai đoạn 1 sẽ nghiên cứu độc tính và nồng độ thuốc tại các trạng thái khác nhau mà ở đó nồng độ thuốc có thể bị thay đổi: ví dụ trạng thái lúc no và lúc đói, người bị suy thận, suy gan. Các cơ chế phản ứng cũng được khảo sát ở nghiên cứu giai đoạn 1.

Nghiên cứu pha 1 trên người tình nguyện khỏe mạnh thường không cần thiết cho các liệu pháp y học cổ truyền dùng thảo dược. Các liệu pháp này đã được sử dụng trên người trước đó và chứng tỏ rằng chúng an toàn trên một số lượng bệnh nhân được theo dõi cẩn thận.

1.2. Giai đoạn 2:

a) Mục đích: Xác định hiệu lực và khẳng định thêm tính an toàn của thuốc đánh giá.

b) Liều: Liều lượng thuốc trong giai đoạn này phải căn cứ vào kết quả của nghiên cứu giai đoạn 1.

c) Cỡ mẫu: Tiến hành trên một số bệnh nhân hạn chế từ 30 đến 50 bệnh nhân và chia làm 2 nhóm (nhóm thuốc đánh giá và nhóm đối chứng) hoặc chỉ có nhóm bệnh nhân dùng thuốc cần đánh giá.

d) Những điểm cần lưu ý: Nghiên cứu giai đoạn 2 đánh giá hiệu lực của các dạng bào chế đối với bệnh trên các cá thể khác nhau. Các thử nghiệm giai đoạn 2 cơ bản bắt đầu bởi đánh giá liều dung nạp tối đa đã được đưa ra trong nghiên cứu giai đoạn 1 trên người tình nguyện khỏe mạnh. Nếu liều này có hiệu quả, khoảng liều giảm dần sẽ được khảo sát. Nếu liều theo nghiên cứu giai đoạn 1 không có hiệu quả, một liều cao hơn có thể được sử dụng để đánh giá hiệu lực tác dụng với khả năng không dung nạp ở mức độ nhẹ, do đó có thể cần khảo sát liều tăng dần. Khảo sát liều trong giai đoạn 2 thực hiện trên số lượng nhỏ bệnh nhân mỗi nhóm. Có thể thực hiện trên cả nhóm dùng giả dược và nhóm can thiệp

1.3. Giai đoạn 3:

a) Mục đích: khẳng định lại tính an toàn và hiệu lực của thuốc trong điều kiện mở rộng.

b) Liều: Liều dung nạp tối đa đã được đưa ra trong nghiên cứu giai đoạn 2.

c) Cỡ mẫu: được lựa chọn phù hợp từ 100 đến 120 bệnh nhân trở lên. Phương pháp đánh giá tốt nhất là thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng mù đôi. Trường hợp không thể làm mù đôi, một thiết kế thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên nhãn mở có thể được chấp nhận.

d) Những điểm cần lưu ý: Nghiên cứu giai đoạn 3 được thực hiện để mở rộng việc đánh giá tính an toàn và hiệu lực. Nghiên cứu này được tiến hành sau khi có các bằng chứng sơ bộ về hiệu lực điều trị của sản phẩm và tập hợp các thông tin về tính hiệu lực và an toàn cần thiết để đánh giá tỷ lệ lợi ích - nguy cơ của điều trị can thiệp, cung cấp các kiến thức cơ bản về liều sử dụng. Nghiên cứu pha 3 được thực hiện trên một số lượng lớn bệnh nhân bao gồm những tập hợp đối tượng có đặc tính tuyển chọn rộng hơn so với thử nghiệm pha 2, và kết quả so sánh trên thống kê giữa nhóm can thiệp chuẩn và nhóm giả dược.

1.4. Giai đoạn 4:

a) Mục đích: thu thập thêm bằng chứng về an toàn và hiệu quả sau khi thuốc đã được sản xuất và sử dụng rộng rãi.

b) Cỡ mẫu: từ 300 bệnh nhân trở lên và được thực hiện ít nhất ở 3 trung tâm của nhiều vùng trong cả nước. Phương pháp đánh giá như ở giai đoạn 2 và 3.

2. Các yêu cầu về Thực hành tốt lâm sàng (GCP) cho các sản phẩm đông y, thuốc từ dược liệu

Thực hành tốt lâm sàng cần được áp dụng cho tất cả các bước trong thử nghiệm lâm sàng để đảm bảo chất lượng và những yêu cầu về đạo đức. Do đó, những thầy thuốc đông y, những người đã quen thuộc với sản phẩm thảo dược đồng thời là người đề xuất nghiên cứu nên tham gia vào nhóm phát triển đề cương. Đối với tất cả các thử nghiệm lâm sàng, các thống kê viên cũng nên được tư vấn để đảm bảo cỡ mẫu đủ cho đánh giá hiệu quả/mục tiêu đề ra.

2.1. Các hướng dẫn chung về thử nghiệm lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu

- Tất cả các nghiên cứu thuốc đông y, thuốc từ dược liệu trên đối tượng nghiên cứu là con người phải được tiến hành theo Hướng dẫn chung về đạo đức trong nghiên cứu y sinh học.

- Khi chế phẩm từ dược liệu đã được chứng minh cơ chế, các nghiên cứu phục vụ cho mục đích thương mại cuối cùng phải được đánh giá theo Hướng dẫn ICH-GCP, GMP và Thông tư 03/2012/TT-BYT.

- Nghiên cứu về thuốc từ dược liệu, ngoài đánh giá hiệu quả điều trị, tính an toàn, các tác dụng không mong muốn, khả năng dung nạp của thuốc, cần chú ý đến tương tác với các thuốc khác, tương tác với thức ăn và đồ uống.

2.2 Một số hướng dẫn cụ thể

- Bản chấp thuận tham gia nghiên cứu phải cung cấp đầy đủ các thông tin liên quan đến nghiên cứu, đặc biệt nêu rõ các dữ liệu về thuốc nghiên cứu như: cách pha chế, tương tác thuốc, độc tính hoặc các tác dụng không mong muốn, liều lượng ...và cần nói rõ với đối tượng tham gia nghiên cứu khi lấy ý kiến chấp thuận tham gia nghiên cứu.

- Các thử nghiệm lâm sàng có đối chứng placebo cần phù hợp với các quy định sử dụng placebo như trong phần Hướng dẫn về đạo đức trong Thử nghiệm lâm sàng thuốc tân dược.

- Hiệu quả điều trị của thuốc đông y, thuốc từ dược liệu thường được đánh giá bằng sự cải thiện hay mất các triệu chứng bệnh hoặc các biến cố liên quan đến bệnh tật, chất lượng sống và trạng thái sức khỏe của đối tượng nghiên cứu.

- Hợp đồng liên quan đến chia sẻ lợi ích và bản quyền, đặc biệt đối với các sản phẩm cây thuốc bản địa, cần phải thiết lập ngay trong giai đoạn lập kế hoạch nghiên cứu.

- Kết quả nghiên cứu về giá trị của cây thuốc/bài thuốc y học cổ truyền cần được chia sẻ với cộng đồng nơi có xuất xứ bài thuốc; cần được lưu giữ, phổ biến rộng rãi trong cộng đồng để góp phần cải thiện sức khỏe, nâng cao chất lượng cuộc sống cho mọi người dân.

Phụ lục 1: Ngoại suy liều thể tích dung dịch mẫu thử dung cho ĐVTN, phân loại độc

1.1 Bảng ngoại suy liều tương đương giữa các loài [3]

Cách tính: Từ loài động vật thực nghiệm (ở cột dọc), đối chiếu theo hàng ngang tới cột loài cần ngoại suy được hệ số cần phải nhân theo bảng trên.

Ví dụ:

- Biết liều có đáp ứng trên người là 10 mg/kg. Tính liều có đáp ứng trên chuột nhắt:

10mg/kg x 11,76 = 117,6mg/kg.

Vậy liều dùng cho một chuột nhắt nặng 20g là:

117,6 mg/kg x 20; 1000 = 2,352 mg.

- Tương tự, nếu tính ngược lại: biết liều có đáp ứng trên chuột cống là 15 mg/kg.

Tính liều có đáp ứng tương đương trên người:

15 mg/kg x 0,15 = 2,55 mg/kg

Nếu tính cho người lớn có trọng lượng khoảng 50 kg, liều có tác dụng là:

2,25 mg/kg x 50 = 112,5 mg.

1.2 Thể tích tối đa dung dịch thuốc có thể sử dụng cho động vật [10]

IV: tiêm tĩnh mạch, IM: tiêm bắp, IP: tiêm hốc bụng; SC: tiêm dưới da.

* Phân bố trên một khoảng da rộng

** Có thể tiêm vào những chỗ khác nhau

1.3 Bảng phân loại độc tính cấp theo giá trị LD50 gần đúng [4,5]

(Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures)

Phụ lục 2: Phương pháp xác định LD50 trong thử độc tính cấp

2.1 MÔ HÌNH LIỀU CỐ ĐỊNH (OECD 420)

Tùy kết quả thử nghiệm và bảng phân loại GSH để xếp loại mức độ độc của mẫu thử. Hướng dẫn quá trình thử và cách xác định giá trị LD50 ước tính được mô tả cụ thể trong sơ đồ 1,2.

2.2 MÔ HÌNH LIỀU TĂNG - GIẢM (OECD 425)

Lập bảng kết quả của từng ĐVTN đã thử

Cột 1: Các bước thí nghiệm: đánh số từ 1 - 15 (có nghĩa là thử nghiệm này không nên dùng quá 15 ĐVTN)

Cột 2: Đánh chữ C với từng ĐVTN đã thử

Cột 3: Mức liều ứng với ĐVTN đã thử

Cột 4: Đáp ứng (đánh chữ X = chết; O = sống)

Xem các ví dụ ở bảng 2 và 3

Xác định cỡ mẫu thực tế và danh nghĩa (n): cỡ mẫu danh nghĩa tính từ 2 con vật tạo nên cặp đảo ngược đầu tiên (trong ví dụ ở bảng 2 và 3 là ĐVTN thứ 2 và 3), cộng với tất cả những ĐVTN đã thử tiếp sau đó. Ghi vào cột 5 nếu ĐVTN đó có được tính vào cỡ mẫu hay không. Tính tổng các ĐVTN đã được tính vào cỡ mẫu thực tế/ danh nghĩa.

Tính LD50 gần đúng

- Giá trị LD50 gần đúng được xác định là trung bình nhân (căn bậc n của tích số n giá trị liều) của các mức liều cho những ĐVTN đã được tính vào cỡ mẫu danh nghĩa. (cột 6) Trong ví dụ ở bảng 2 là 31,02 và ví dụ bảng 3 là 1292,78.

Xác định tính hợp lý (Likelihood) cho giá trị LD50 gần đúng

Sử dụng phương pháp thống kê Likelihood để xác định tính hợp lý của giá trị LD50 gần đúng đã xác định.

Xác định xem giá trị xác suất tính được có vượt quá giới hạn cho phép (2,5) lần hay không

- Kiểm tra giá trị LD50

+ Tính giá trị Zi của từng con vật

Tính Zi =

Trong đó:

Di = Liều đã thử cho con đó

Sigma = 1/độ dốc đã chọn

mu = logLD50 gần đúng                   Xem ví dụ c (log10 1292,8 = 3,112)

+ Tính xác suất của đáp ứng (Pi)

Pi - F(Zi)

Trong đó, F là 1 hàm phân bố tích lũy cho phân bố chuẩn (tính theo phần mềm trong excel, sử dụng hàm NORMDIST) với các hàm số:

Zi = giá trị đã tính được ở trên

mean = 0

Standard = 1

Cumulative = True/Fail

Ghi giá trị Pi của từng con vào bảng.

- Tính giá trị phân bố hợp lý (Li) cho từng con:

Với con vật chết (có đáp ứng) Ln_(Li) = Ln_(Pi)

Với con sống (không đáp ứng) Ln_(Li) = Ln_(1-Pi)

Ghi vào bảng các giá trị đã tính được

Tính tổng  của tất cả các con vật đã thử

Tính các giá trị Likelihood bằng đối logarit tự nhiên của giá trị

VD: antiln (-3.389) = e^-3.389 = 0.0337

Tính giá trị Likelihood cho giới hạn LD50 trên và dưới

Giới hạn trên = LD50 x 2,5

Giới hạn dưới = LD50/2,5

Tính tỷ số hợp lý LR (Likelihood - ratios)

Sử dụng 3 giá trị Likelihood (LD50, giới hạn trên và dưới) để tính LR. Tỷ lệ hợp lý được sử dụng để so sánh giữa giá trị LD50 gần đúng với các mức giới hạn trên và dưới (xem ví dụ C)

LR1 = [likelihood của 1292,8]/ [likelihood của 517,1]

= 0,0337/0.0080 = 4,21

LR1 = [likelihood của 1292,8]/ [likelihood của 3232,0]

= 0,0337/0.0098 = 3,44

Xác định xem tỷ lệ likelihood (giá trị LR) có vượt quá giá trị tiêu chuẩn không.

Nếu các giá trị LR thực nghiệm lớn hơn giá trị giới hạn 2,5, có nghĩa là tiêu chuẩn dừng thí nghiệm đã thỏa mãn và kết quả chấp nhận.

Nếu giá trị LR thực nghiệm nhỏ hơn giá trị giới hạn 2,5, cần hiệu chỉnh kết quả hoặc chấp nhận kết quả gần đúng.

Sơ đồ 1: Sơ đồ hướng dẫn thử nghiệm chính, liều khởi đầu 5mg và 50mg

Sơ đồ 2: Sơ đồ hướng dẫn thử nghiệm chính, liều khởi đầu 300mg và 2000mg

Table 1 continued

* If lower doses are needed, continue progressions to a lower dose

Bảng 3: Ví dụ về tiêu chuẩn dừng (c)

2.3 Tính LD₅₀ theo Behrens

Lập bảng tính kết quả (xem ví dụ) trong đó % chết tính bằng số chuột chết chia cho tổng số chuột (chết và sống) ở cột kỳ vọng.

Vẽ đồ thị theo số liệu trên bảng: trục tung: % chết; trục hoành: mức liều (tính bằng mg hoặc g/kg chuột).

Tính theo giá trị LD₅₀ theo công thức sau:

Trong đó: A - liều gây chết a% ĐVTN

a - % ĐVTN chết sát dưới 50% sao cho a < 50%

b - % ĐVTN chết sát trên 50% sao cho b > 50%

d: khoảng cách giữa các liều

Tính sai số chuẩn:

Trong đó: k: hệ số Behrens = 0,66

n: Số chuột trong mỗi nhóm

d: khoảng cách giữa các liều

Ví dụ:

Vẽ đồ thị theo các số liệu trên bảng

Theo đồ thị, ta có: LD₁₆ = 164 mg/kg: LD₈₄ = 183 mg/kg

2.4 Tính LD₅₀ theo Litchfield - Wilcoxon

Lập bảng ghi kết quả: (xem ví dụ) tỷ lệ chết

Ghi kết quả trên giấy log-probit, trừ điểm 0% và 100%. Hoành độ là liều dùng và tung độ là tỷ lệ chết %.

Kẻ đường biểu diễn tạm thời (đường hồi qui) đi gần các điểm thực nghiệm nhất, đặc biệt chú ý đến các điểm trong khoảng chết từ 40 - 60%.

Ghi tỷ lệ chết kỳ vọng: Từ đường biểu diễn mới kẻ, đọc và ghi lại tỷ lệ chết kỳ vọng ứng với các liều đã dùng.

Tính các giá trị cho tỷ lệ chết 0% và 100%: theo bảng I, dựa vào tỷ lệ chết kỳ vọng. Trong ví dụ, tỷ lệ chết kỳ vọng của 0%và 100% là 2,8 và 94,5%. Đối chiếu với bảng I, ta được 0,94 và 98,2%. Ghi các giá trị mới này lên đồ thị. Kiểm tra xem đường biểu diễn mới kẻ có đi gần các điểm này không. Nếu không, phải kẻ lại đường khác và tính lại.

Tính hiệu số (trị tuyệt đối) giữa hai tỷ lệ % chết thực nghiệm và chết kỳ vọng của từng mức liều. Nhờ toán đồ I, tính giá trị X² cho từng liều bằng cách dùng các thước nhựa trong vạch 1 đường thẳng, bên trái là giá trị % kỳ vọng, đường giữa là hiệu số khác nhau giữa hai tỷ lệ % vừa tính ở trên. Điểm cắt của đường này với đường bên phải là giá trị X².

Tính tổng giá trị X² của tất cả các liều. Tính giá trị X² của đường biểu diễn bằng cách nhân tổng số X² với số trung bình súc vật cho một liều (N/K) vì số súc vật dùng cho mỗi nhóm có thể khác nhau.

K: tổng số các mức liều đã dùng

N: tổng số súc vật đã dùng

N/K: số súc vật trung bình của 1 nhóm

n = K-2: độ tự do của phép thử

Giá trị X² của đường biểu diễn =  X² x N/K

Tìm giá trị X² ở bảng II với xác suất P=0,05 và độ tự do n=K-2

So sánh giá trị X² của đường biểu diễn với giá trị X² trong bảng. Nếu giá trị X²  thực nghiệm nhỏ hơn thì đường hồi qui đã kẻ là chấp nhận được. Nếu lớn hơn thì phải kẻ lại và tính lại từ đầu.

Tính giới hạn tin cậy của LD₅₀

- Đọc và ghi các giá trị liều gây chết LD₁₆; LD₅₀; LD₈₄ trên đồ thị.

- Tính độ dốc của đường biểu diễn:

- Tính tổng số súc vật N’ đã dùng trong khoảng chết giữa 16%-84% theo giá trị kỳ vọng.

- Tính hệ số điều chỉnh fLD50:

- Đọc kết quả  trên toán đồ II: đường bên phải là giá trị S, đường bên trái là giá trị  (trong ví dụ, S = 1,32 và 2,77 : N’ = 0,178); giao điểm của đường thẳng nối 2 điểm này với đường giữa của toán đồ II là kết quả fLD₅₀

- Với xác suất P = 0,05, các giới hạn của LD₅₀ sẽ là:

+ Giới hạn trên: LD₅₀ x fLD₅₀

+ Giới hạn dưới: LD₅₀: fLD₅₀

Tính giới hạn tin cậy của đường hồi qui S:

1. Tính tỷ lệ R: Tỷ lệ giữa liều cao và liều thấp nhất đã dùng.

2. Theo toán đồ III, đối chiếu giá trị S theo đường bên trái và R theo đường bên phải, nối S và R, điểm cắt ở giữa là A.

3. Hệ số điều chỉnh của độ dốc S của đường hồi qui là:

Dùng toán đồ II để tính fS, đường bên trái là giá trị A, đường bên phải là trị số mũ. Giao điểm của đường nối với đường giữa là giá trị fS.

4. Với P = 0,05:

- Giới hạn trên của S là: S x fS

- Giới hạn dưới của S là: S / fS

Những giới hạn này cho biết khoảng tin cậy của các điểm khác với LD₅₀.

Nết test X² chứng tỏ có sự không phù hợp, phải sử dụng phương pháp tính dựa trên hệ số t của bảng II:

Vi dụ: Thử độc tính cấp của cocain hydrochlorid trên chuột nhắt trắng

N = 326 ; N = 69 + 95 + 78 = 242

K = 6     ; n = 6 - 2 = 4

Số súc vật trung bình cho một nhóm: N/K = 326 : 6 = 54,3.

X² của đường biểu diễn: 0,094 x 54,3 = 5,09

X² trong bảng với bậc tự do = 4 là 9,49, lớn hơn giá trị X² của đường hồi qui. Như vậy đường biểu diễn đã kẻ là chấp nhận được.

Đọc trên đồ thị: LD₁₆ = 0,0195                LD₈₄ = 0.0340

                         LD₅₀ = 0,0255

fLD₅₀ = 1,32^0,178 = 1,05

Giới hạn trên của LD₅₀ = 0,0255 x 1,05 = 0,0268

Giới hạn dưới của LD₅ = 0,0255 : 1,05 = 0,0243

LD₅₀ = 0,0255 mg/kg (0,0243 - 0,0268)

Tính giới hạn tin cậy của độ dốc của đường hồi qui S

R = 0,040: 0,015 = 2,66

Theo toán đồ III, biết S và R, tìm được A:           A = 1,09

Hệ số điều chỉnh fS

Theo toán đồ III ---> = 1,047

Với xác suất P = 0,05

Giới hạn trên của S: S x fS = 1,32 x 1,047 = 1,38

Giới hạn dưới của S: S/fS = 1,32 /1,047 = 1,26

1,26 < S < 1,38

Phụ lục 3 Hồ sơ khoa học đính kèm nguyên liệu dùng làm thuốc đông y, thuốc từ dược liệu đối với vị thuốc chưa có trong Dược điển Việt Nam hoặc Dược điển nước ngoài

Nguyên liệu dùng làm thuốc phải được kèm theo một hồ sơ khoa học ghi nhận đầy đủ những đặc điểm dưới đây nếu dược liệu đó chưa có trong Dược điển Việt Nam:

a, Tên gọi và những đặc điểm chung:

Tên gọi gồm có:

- Tên gọi của vị thuốc bằng tiếng Việt Nam, tiếng la tinh, tiếng Anh (khi xuất khẩu).

- Tên gọi của cây thuốc bằng tên khoa học, bao gồm tên họ, tên chi, tên loài, thứ và tên tác giả có liên quan tới việc xác định tên khoa học đó.

Ngoài ra còn cần phải:

- Nêu rõ bộ phận dùng làm thuốc, tình trạng nguyên liệu, (thí dụ lá, hoa, cành, rễ, thân rễ... để tươi hay đã bào chế, để nguyên dạng hay thái phiến...)

- Nơi thu hái, điều kiện sống (môi trường phát triển của cây), cây trồng hay thu hái hoang dã, kèm theo ảnh màu chụp cả cây và bộ phận dung.

- Ghi rõ thời gian và cách thức thu hái cây thuốc, các quá trình sơ chế, chế biến.

- Nói rõ thành phần hoạt chất, hoặc các phân đoạn có tác dụng điều trị theo các tài liệu tham khảo đã có, kèm theo công thức cấu tạo của hoạt chất.

- Nếu nguyên liệu dùng làm thuốc đã được chế biến thì cần cho biết sự thay đổi về thành phần hoạt chất sau khi chế biến.

b, Tiêu chuẩn chất lượng

Tính xác thực của nguyên liệu:

Mô tả những nhận định cảm quan (hình dạng, mùi, vị, màu sắc), đại thể và vi thể (vi phẫu), soi bột dược liệu qua kính hiển vi. Nhận biết các hoạt chất và các chất đặc trưng bằng các phản ứng hóa học đặc trưng và bằng sắc ký lớp mỏng. Các kết quả phân tích trên phải được vẽ hoặc chụp ảnh màu. Nếu chưa biết rõ thành phần hoạt chất, thì có thể xác định nguyên liệu làm thuốc bằng một bản sắc ký lớp mỏng có nhiều chi tiết của một dịch chiết tiêu chuẩn. Bản sắc ký này được coi như dấu vân tay (finger prin) của cây thuốc. Nêu rõ điều kiện chiết, điều kiện chạy sắc ký và phun thuốc thử.

Độ tinh khiết của nguyên liệu:

Nêu rõ giới hạn cho phép các kim loại nặng độc (As, Hg, Pb, Cd), giới hạn thuốc bảo vệ thực vật về sự có mặt của các tạp chất vô cơ và hữu cơ lạ (thí dụ: các bộ phận của những cây khác, đất, cát lẫn vào). Những tạp chất có giới hạn nói trên phải không độc và không có màu, không có mùi.

Thử nghiệm:

Nêu rõ các phương pháp hóa lý và sinh học cần thiết để đánh giá sự có mặt của hoạt chất, chất đặc trưng, hoặc những phân đoạn của dịch chiết có hoạt tính điều trị, kèm theo các phạm vi giới hạn cho phép, nhằm phục vụ khâu kiểm nghiệm theo đúng các quy trình của Dược điển Việt Nam IV.

Đối với những cây thuốc mới cần dựa cả vào những công trình nghiên cứu khoa học đã được các tác giả công bố chính thức và những dược điển chính thức của những nước khác (Trung Quốc, Anh, Pháp, Nga, Mỹ...).

Đóng gói và bảo quản:

Phần lớn các nguyên liệu có thể được đóng gói trong các bao bì thông dụng. Đối với các loại dễ bị sâu bọ đục khoét và các nguyên liệu có chứa tinh dầu dễ bay hơi thì phải đựng trong thùng gỗ kín, khô, hay trong các túi nhựa. Đối với các nguyên liệu dễ hút ẩm và biến chất phải đựng trong các bao bì thích hợp có thêm chất hút ẩm và nút thật kỹ.

Nhãn ghi bên ngoài: Phải ghi đủ trọng lượng có và không có bao bì, ngày thu hái, ngày đóng gói, thời gian có thể bảo quản, chế độ bảo quản và số lô đóng gói nơi sản xuất.

Bảo quản thuốc sống, thuốc chín:

Kho chứa thuốc đạt tiêu chuẩn GSP (Good Storage Practices - Thực hành tốt bảo quản thuốc).

Phải có chế độ bảo quản riêng đối với thuốc có độc.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bộ Y tế. Hướng dẫn về thử thuốc trên lâm sàng, ban hành kèm theo Thông tư số 03/2012/TT-BYT ngày 16 tháng 02 năm 2012 của Bộ trưởng Bộ Y tế.

2. Bộ Y tế. Hướng dẫn thực hành tốt thử thuốc trên lâm sàng, ban hành kèm theo Quyết định số 799/2008/QĐ-BYT ngày 7 tháng 03 năm 2008 của Bộ trưởng Bộ Y tế.

3. Bộ Y tế. Quyết định số 371/BYT-QĐ ngày 12 tháng 3 năm 1996 về việc ban hành “Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền”.

4. Bộ Y tế. Quy định về thử thuốc trên lâm sàng, ban hành kèm theo Quyết định số 01/2007/QĐ-BYT ngày 11 tháng 01 năm 2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế.

5. Bộ Y tế. Điều lệ Y tế Quốc tế (Bản tiếng Việt, dịch từ “Internatinal Health Regulations” WHO Document Services, Geneva, Switzerland. Hà Nội, 2007.

6. Bộ Y tế. Hướng dẫn thử nghiệm trên lâm sàng. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, năm 2010.

7. Nguyễn Thị Kim Tiến (chủ biên). "Thử nghiệm lâm sàng vắc xin tại Việt Nam". Nhà xuất bản Y học, năm 2011.

Tiếng Anh

8. WHO. Operational guidance: information needed to support clinical trials of herbal products.