|
Tiến hành định lượng nhanh nhất có
thể trong điều kiện tránh ánh sáng, không khí và các chất oxy
hóa, các chất xúc tác sự oxy hóa (như đồng, sắt), acid và tránh đun nóng
(với vitamin A có nguồn gốc tự nhiên), tránh đun nóng kéo dài với retinol
tổng hợp đậm đặc dạng dầu. Sử dụng các dung dịch mới pha.
Trong quá trình định
lượng, nếu xảy ra sự kết tinh một phần thì có thể hòa tan
lại chế phẩm bằng cách đun nóng ở 65 °C nhưng tránh
đun nóng kéo dài.
Tùy theo đặc điểm của
vitamin A mà áp dụng
1 trong 3 phương pháp
dưới đây để định
lượng.
1. Phương pháp 1: Phương
pháp đo quang trực tiếp
Có thể áp dụng đối với nguyên liệu là retinol và
các ester của retinol đậm đặc dạng dầu với hàm lượng lớn
Cân chính xác
đến
0,1
%
(so
với lượng cân) khoảng từ 25 mg đến 100 mg chế phẩm và đem hòa tan trong 5 ml pentan,
pha loãng bằng
2-propanol để được dung dịch chứa chính xác khoảng 10 IU đến 15 IU vitamin A
trong
1
ml.
Xác định độ hấp thụ cực đại của dung
dịch đo, nếu cực đại hấp thụ nằm trong khoảng bước sóng từ 325 nm đến 327 nm
thì đo độ hấp thụ của dung dịch tại các bước sóng 300 nm, 326 nm, 350 nm và
370 nm trong cốc đo dày 1 cm, dùng 2-propanol làm mẫu trắng, đo 2 lần lấy giá
trị trung bình làm kết quả đo. Tính tỷ lệ độ hấp thụ tại mỗi bước sóng so với
độ hấp thụ tại bước sóng 326 nm (Aλ/A326).
Nếu tỷ lệ Aλ/A326
không lớn hơn các giá trị ghi dưới đây:
0,60 ở λ = 300 nm
0,54 ở λ = 350 nm
0,14 ở λ = 370 nm
Tính kết quả hàm lượng vitamin A
trong mẫu thử (IU/g) theo
công thức:
Trong đó:
A326 là độ hấp thụ tại
bước sóng 326 nm.
m là lượng chế phẩm đem thử (g).
V là lượng thể tích dung dịch thu
được sau khi pha loãng đến nồng độ 10 IU/ml đến 15 IU/ml đem đo
(ml).
1 900 là hệ số chuyển đổi độ hấp thụ
riêng của ester retinol thành IU/g.
Nếu cực đại hấp thụ nằm ngoài dải
sóng từ 325 nm đến
327 nm hoặc có một giá trị Aλ/A326 lớn hơn giá trị qui
định thì kết quả không có giá trị, tiến hành định lượng theo phương pháp 3.
2. Phương pháp 2: Phương pháp sắc ký
lỏng trực tiếp
Có thể áp dụng đối với các nguyên liệu
vitamin A tổng hợp, các thành phẩm chứa
vitamin A tổng hợp mà
trong thành phần chỉ chứa vitamin A ở một dạng ester đồng nhất
hoặc
dạng retinol.
Pha động: Methanol - ethyl acetat - nước (90 : 7 : 3).
Dung dịch thử: Lấy chính xác một lượng
chế phẩm có chứa khoảng 4 000 IU vitamin A cho vào bình định mức dung
tích 100 ml, thêm ethanol, lắc kỹ rồi thêm ethanol đến định mức, lắc
đều, lọc.
Dung dịch chuẩn: Pha chất chuẩn
vitamin A (dạng giống với dung dịch thử: retinol, retinyl acetat, retinyl
palmitat...) trong ethanol để thu được dung dịch chuẩn có nồng độ
vitamin A chính xác khoảng 40 IU/ml.
Điều kiện sắc ký:
Cột kích thước (25 cm x 4 mm) được
nhồi pha tĩnh C 18 (5 µm
đến 10
µm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở
bước sóng 325 nm.
Tốc độ dòng: 1,5 ml/min đến
2,0 ml/min.
Thế tích tiêm: 20 µl.
Cách tiến hành:
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống
sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối (RSD)
của diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của 6 lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn
không được lớn hơn 2,0 %.
Tiến hành sắc ký lần lượt với dung
dịch chuẩn và dung dịch thử.
Cách tính kết quả:
Hàm lượng vitamin A trong mẫu thử (IU/g) được
tính theo công thức:
Trong đó:
ST và SC là diện tích
của pic vitamin A trên sắc đồ của mẫu thử và chuẩn;
m là lượng cân mẫu thử (g);
C là nồng độ vitamin A trong dung dịch
chuẩn (IU/ml).
Chú ý:
Nếu mẫu thử có nhiều thành phần dạng
dầu thì nên thêm 2
ml
ethyl acetat hoặc 2 ml
n-hexan và lắc kỹ trước khi cho ethanol vào để hòa tan.
3. Phương pháp 3: Phương
pháp sắc ký lỏng
sau khi thủy
phân
Pha động: Methanol - nước (95:5).
Dung dịch thử (1): Đối với nguyên
liệu dạng dầu hoặc nhũ tương: Cân 0,100 g chế phẩm vào bình định mức 100 ml.
Hòa tan ngay trong 5 ml pentan. Thêm 40 ml dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd
0,1 M trong 2-propanol. Khuấy nhẹ và để thủy phân trong cách thủy ở 60 °C đến 65 °C trong 10
min, thỉnh thoảng khuấy nhẹ. Để nguội đến nhiệt độ phòng, rồi pha loãng thành
100,0 ml bằng 2-propanol có chứa 0,1 % butyl hydroxytoluen. Lắc cẩn thận
tránh tạo bọt khí.
Dung dịch thử (2): Pha loãng dung
dịch thử (1) bằng 2-propanol để thu được dung dịch có nồng độ 100 IU/ml.
Dung dịch chuẩn (1): Cân chính xác
0,100 g retinyl acetat chuẩn (hàm lượng khoảng 1 000 000 IU/g) vào
bình định mức 100 ml và tiến hành như dung dịch thử (1) đối với dung dịch
nguyên liệu dạng dầu hoặc nhũ tương.
Dung dịch chuẩn (2): Pha loãng 5,0
ml dung dịch chuẩn (1) thành 50,0 ml bằng 2-propanol. Lắc cẩn thận tránh tạo
bọt khí.
Điều kiện sắc ký:
Cột kích thước (12,5 cm x 4 mm) được
nhồi pha tĩnh C 18 (5 µm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở
bước sóng 325 nm.
Tốc độ dòng: 1 ml/min;
Thể tích tiêm: 10 µl.
Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký
dung dịch thử (2) và dung dịch chuẩn (2) với thời gian gấp 1,5 lần thời gian lưu của
retinol.
Thơi gian lưu của retinol khoảng 3 min.
Cách tính kết quả: Hàm lượng
vitamin A trong mẫu thử
(IU/g) được tính theo công thức:
Trong đó:
ST, SC là diện
tích pic của retinol trên sắc
đồ của dung dịch thử
và
dung dịch chuẩn;
mC , mT là
lượng cân mẫu chuẩn, thử (mg);
C là hàm lượng retinyl acetat chuẩn
được xác định theo phương pháp 1 (IU/g);
F là độ pha loãng của dung dịch thử.
|
