|
BỘ Y TẾ
-----
|
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-------
|
|
Số: 3347/2001/QĐ-BYT
|
Hà Nội, ngày 31
tháng 7 năm 2001
|
QUYẾT
ĐỊNH
VỀ
VIỆC BAN HÀNH "THƯỜNG QUY KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH -
PSEUDOMONAS AERUGINOSA - TRONG THỰC PHẨM"
BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ
Căn cứ theo Nghị định
số 68/CP ngày 11/10/1993 của Chính phủ quy định chức năng, nhiệm vụ, quyền hạn
và tổ chức bộ máy của Bộ Y tế;
Căn cứ theo Nghị định số 86/CP ngày 08/12/1995 của Chính phủ về việc phân công
trách nhiệm quản lý nhà nước đối với chất lượng hàng hóa;
Căn cứ theo Quyết định số 14/1999/QĐ-TTg ngày 04/02/1999 của Thủ tướng Chính
phủ về việc thành lập Cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm;
Theo đề nghị của Chánh văn phòng, Vụ trưởng Vụ Khoa học Đào tạo, Vụ trưởng Vụ
Pháp chế, Chánh thanh tra - Bộ Y tế và Cục trưởng Cục Quản lý chất lượng vệ
sinh an toàn thực phẩm,
QUYẾT ĐỊNH
Điều
1.
Ban hành kèm theo Quyết định này “Thường quy kỹ thuật
định lượng trực khuẩn mủ xanh - Pseudomonas aeruginosa - trong thực phẩm”.
Điều
2.
Quyết định này có hiệu lực kể từ ngày ký ban hành.
Điều
3.
Các Ông, Bà: Chánh văn phòng, Chánh thanh tra, Vụ trưởng
các Vụ: Khoa học Đào tạo, Pháp chế, Y tế dự phòng- Bộ Y tế; Cục trưởng Cục Quản
lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, Giám đốc Sở Y tế các Tỉnh,Thành phố
trực thuộc Trung ương và Thủ trưởng các đơn vị trực thuộc Bộ Y tế chịu trách
nhiệm thi hành Quyết định này./.
|
|
KT. BỘ TRƯỞNG BỘ Y
TẾ
THỨ TRƯỞNG
Lê Văn Truyền
|
THƯỜNG
QUY KỸ THUẬT
ĐỊNH
LƯỢNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH (PSEUDOMONAS AERUGINOSA) TRONG THỰC PHẨM
(Ban
hành kèm theo Quyết định số 3347/ QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế)
I. NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP
Sử dụng phương pháp
cấy đếm Pseudomonas aeruginosa trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt, sau
khi ủ ấm ở nhiệt độ 420C trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ
xác định Pseudomonas aeruginosa bằng các thử nghiệm sinh vật hóa học
theo thường quy.
II. PHẠM VI ÁP DỤNG
Phát hiện các ô nhiễm
do Pseudomonas aeruginosa trong sản phẩm thực phẩm hoặc thực phẩm đã được
chế biến sẵn.
III. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ
1. Dụng cụ, thiết bị
Dụng cụ và thiết bị
chuyên dụng trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật.
2. Môi trường, thuốc
thử
- Thạch Pseudomonas
(Pseudomonas agar)
- Thạch dinh dưỡng
(Nutrient agar)
- Canh thang BHI
(Brain Heart Infusion)
- Nước muối đệm
pepton 9‰ (Buffer Pepton Water - BPW)
- Môi trường sinh vật
hoá học: Kligler (KIA); Lysin decarboxylaza (LDC), Citrat Simmon, Ure-indol
- Thuốc thử oxidaza,
Kowac.
- Bộ thuốc nhuộm
Gram.
IV. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ
1. Chuẩn bị môi
trường
Môi trường nuôi cấy,
canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo
công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và
được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút).
2. Chuẩn bị mẫu và
dung dịch mẫu thử
2.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu thực phẩm được
cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể
đồng nhất.
2.2. Chuẩn bị dung
dịch mẫu thử 10-1
Cân chính xác 25g
thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 25ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón
chứa sẵn 225 ml nước muối đệm pepton (BPW) 9‰. Lắc đều 2 - 3 phút, thu được
dung dịch mẫu thử 10-1.
2.3. Chuẩn bị dung
dịch mẫu thử 10-2,10-3,10-4....
- Hút chính xác 1ml
dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước muối
đệm pepton 9‰. Lắc đều trong 2-3phút, thu được dung dịch10-2.
- Tiếp tục làm tương
tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4,
10-5.... (theo sơ đồ ).
3. Phương pháp tiến
hành
Bước 1:
- Đánh dấu lên đĩa
thạch nồng độ dung dịch mẫu thử .
- Dùng pipet 1ml vô
trùng, hút chính xác 0,1 ml từ dung dịch thử 10-1, nhỏ lên bề mặt
đĩa thạch Pseudomonas đã đánh dấu nồng độ dung dịch mẫu thử tương ứng.
- Dùng que cấy kim
loại hoặc que cấy thủy tinh ria đều để dung dịch mẫu được phân bố khắp mặt
thạch sao cho các khuẩn lạc mọc phân tán đều.
- Ủ 420C/
24 giờ. Đọc kết quả.
Lưu ý: Thạch nuôi cấy phải
được hong khô trước khi dùng. Mỗi mẫu thực phẩm phải được nuôi cấy ít nhất
trong 3 đậm độ pha loãng. Mỗi đậm độ pha loãng phải được cấy lên 2 đĩa thạch
để tính trung bình cộng của mỗi đậm độ.
Bước 2: Đọc kết quả:
- Đọc kết quả sau 24
giờ: đếm toàn bộ các khuẩn lạc có các đặc tính: tròn đều, mặt nhẵn, có sinh sắc
tố màu xanh (nõn chuối, xanh lá mạ, xanh lục), có mùi thơm đặc trưng. Đánh dấu
các khuẩn lạc nghi ngờ. ủ tiếp 24 giờ/ 420C.
- Đọc kết quả sau 48
giờ: Đếm các khuẩn lạc nghi ngờ xuất hiện thêm (chủ yếu là các khuẩn lạc có sắc
tố xanh).
Tính kết quả theo
công thức:
Trong đó :
S C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên
tất cả các đĩa được giữ lại ở hai nồng độ pha loãng liên tiếp, ít nhất có một
đĩa chứa trên 15 khuẩn lạc.
V: Thể tích mẫu cấy
trên môi trường đĩa
n1 : Số đĩa được giữ
lại ứng với độ pha loãng ban đầu
n2: Số đĩa
được giữ lại ứng với độ pha loãng thứ 2
d: Hệ số pha loãng
thứ nhất được giữ lại để tính kết quả
Ví dụ : Nồng độ 10-2
có 168 khuẩn lạc (đĩa 1) và 215 khuẩn lạc (đĩa 2)
Nồng độ
10-3 có 14 khuẩn lạc (đĩa 1) và 25 khuẩn lạc (đĩa 2)
|
x
|
168 + 215 + 14 + 25
|
=
|
422
|
= 191.818
|
|
0,1 (2 +
0,1 ´ 2) 10-2
|
0,0022
|
Như vậy, có 19.104
vi khuẩn trong 1g mẫu thử
* Ghi chú:
- Chỉ đếm các đĩa
thạch có số khuẩn lạc không vượt quá 300 để tính kết quả.
- Nếu các khuẩn lạc
phân bố trên đĩa nuôi cấy không rõ ràng thì phải làm lại.
Bước 3: Xác định hình thể và
tính chất bắt mầu
- Lấy khuẩn lạc nghi
ngờ nhuộm Gram: Trực khuẩn hình gậy kích thước 2 - 3m, không bắt mầu thuốc nhuộm Gram, Gr
(-)
- Thử test Oxidaza
Bước 4: Tăng sinh thuần
chủng và xác định tính chất sinh vật hoá học
4.1. Tăng sinh thuần
chủng
- Trích biệt khuẩn
lạc nghi ngờ cho vào ống canh thang BHI.
- Ủ ấm 370C/
24 giờ. Thu được canh trùng thuần nhất.
4.2. Thử tính chất
sinh vật hoá học
Lấy canh trùng thuần
nhất để thử các tính chất sinh vật hóa học:
- Lên men đường
glucoza
- Lên men đường
lactoza, sinh hơi, sinh H2S.
- Sử dụng carbon
trong môi trường citrat simom
- Khả năng sinh Indol
- Khả năng sinh men
decarboxylaza.
Nếu cần: Ngưng kết với kháng
huyết thanh đa giá để chẩn đoán quyết định trực khuẩn mủ xanh lần lượt từ
serotyp P1 đến P16.
Tiêu chuẩn xác định
trực khuẩn mủ xanh
- Trực khuẩn Gr (-)
Oxidaza (+) Khuẩn lạc có mầu xanh
- Glucoza (+)
Lactoza (-)
- Hơi (-) H2S
(-) Citrat simom (-)
- Indol (-)
LDC (-)
Sơ đồ định lượng P.
aeruginosa
1. Đồng nhất mẫu
Thạch Pseudomonas
3. Ủ ấm
Úp ngược đĩa thạch,
để trong tủ ấm. Để 420C/ 20 - 24 giờ.
4. Chọn đĩa thạch: Chọn đĩa có < 300
khuẩn lạc để đếm.
5. Tăng sinh thuần
nhất
6. Xác định tính chất
sinh vật hóa học
Glucoza: (+) Lactoza:
(-) Hơi: (-) H2S: (-)
Citrat simom: (-) Indol:
(-) LDC: (-) Oxidaza: (+)
